蔡恒江，唐學(xué)璽

(1.大連海洋大學(xué)海洋科技與環(huán)境學(xué)院，遼寧大連116023;2.遼寧省高校近岸海洋環(huán)境科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023;3.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生態(tài)學(xué)研究室，山東青島266003)

赤潮是全球性的海洋生態(tài)災(zāi)害。近年來(lái)，中國(guó)近岸海域赤潮發(fā)生的頻率、波及范圍和危害程度呈上升趨勢(shì)。赤潮不僅會(huì)破壞海洋漁業(yè)資源和生產(chǎn)，惡化海洋環(huán)境，影響海濱旅游業(yè)，而且有一些藻類(lèi)在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)排放出毒素，對(duì)人類(lèi)生活直接造成危害，即形成有害赤潮HAB。因此，赤潮已成為當(dāng)前污染生態(tài)學(xué)的研究熱點(diǎn)之一［1］。由于在赤潮的發(fā)生和消亡過(guò)程中各種理化因子和生態(tài)因子相互作用的復(fù)雜性，目前還沒(méi)有找到非常理想的治理方法。利用海洋環(huán)境中的生物因子進(jìn)行赤潮的防控已經(jīng)越來(lái)越引起人們的重視［2－3］，其中利用大型海藻與微藻間的相互作用來(lái)預(yù)防或控制赤潮是一個(gè)新的研究方向［4］。大量研究表明，孔石莼與微藻種群之間會(huì)發(fā)生克生作用［5－6］，這為利用生物學(xué)方法控制赤潮的發(fā)生提供了可能。

用孔石莼進(jìn)行赤潮防控的同時(shí)，其自身生長(zhǎng)也會(huì)受到赤潮微藻的影響。但現(xiàn)今研究多集中于孔石莼對(duì)赤潮微藻的克生作用，而赤潮微藻對(duì)孔石莼生長(zhǎng)的影響報(bào)道較少。研究表明，孔石莼可能會(huì)分泌某種克生物質(zhì)抑制赤潮微藻的生長(zhǎng)［7］，但赤潮微藻對(duì)孔石莼作用途徑的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究中，作者選用大型海藻——孔石莼和赤潮微藻——赤潮異彎藻為試驗(yàn)材料，研究了藻體、培養(yǎng)液濾液和胞內(nèi)物質(zhì)對(duì)生長(zhǎng)相互作用的影響，以期找出孔石莼與赤潮異彎藻間的相互作用途徑，為赤潮防治的生物操縱法的研究提供有價(jià)值的資料。

1 材料與方法

1.1 材料

孔石莼Ulva pertusa采自青島太平角，采回后立即用天然海水洗凈，用打孔器打成直徑為1.3 cm的圓片。

赤潮異彎藻Heterosigma akashiwo取自中國(guó)海洋大學(xué)微藻培養(yǎng)中心，屬赤潮藻種。

1.2 方法

試驗(yàn)前將孔石莼在室溫下預(yù)培養(yǎng)7 d(光照強(qiáng)度為3000 lx)。試驗(yàn)在室內(nèi)光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，培養(yǎng)溫度為 (20±1)℃，光照強(qiáng)度為3000 lx，光周期為12L∶12D。每個(gè)試驗(yàn)均設(shè)4個(gè)平行。

1.2.1 孔石莼與赤潮異彎藻間的克生作用試驗(yàn)

1)孔石莼對(duì)赤潮異彎藻生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)。分別取0、0.05、0.10、0.20、0.40 g孔石莼接種于150 mL f/2培養(yǎng)液中，使其初始接種量分別達(dá)到0(對(duì)照)、0.33、0.67、1.33、2.67 g/L。赤潮異彎藻在指數(shù)生長(zhǎng)期接種 (以下同)，接種的初始密度為1萬(wàn)個(gè)/mL，分別接種到含不同初始質(zhì)量孔石莼的培養(yǎng)液中進(jìn)行試驗(yàn)［8］。

2)赤潮異彎藻對(duì)孔石莼生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)。取0.05 g孔石莼接種于150 mL f/2培養(yǎng)液中，使其初始接種量達(dá)到0.33 g/L。赤潮異彎藻接種的初始密度分 別 為 0(對(duì) 照)、0.5、1.0、2.0、4.0萬(wàn)個(gè)/mL，分別接種到孔石莼培養(yǎng)液中進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 孔石莼與赤潮異彎藻間的濾液交叉培養(yǎng)試驗(yàn)

1)孔石莼濾液對(duì)赤潮異彎藻生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)。分別取0、0.05、0.10、0.20、0.40 g孔石莼接種于150 mL f/2培養(yǎng)液中，使其初始接種量分別達(dá)到0、0.33、0.67、1.33、2.67 g/L。培養(yǎng)12 d后，取出孔石莼，培養(yǎng)液經(jīng)孔徑為0.45 μm的玻璃纖維素濾膜過(guò)濾得到孔石莼濾液，然后經(jīng)f/2營(yíng)養(yǎng)鹽加富后作為赤潮異彎藻的培養(yǎng)液。赤潮異彎藻接種的初始密度為1.0萬(wàn)個(gè)/mL，分別接種到150 mL含不同質(zhì)量的孔石莼濾液中。

2)赤潮異彎藻濾液對(duì)孔石莼生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)。赤潮異彎藻初始接種密度分別為 0、0.5、1.0、2.0、4.0萬(wàn)個(gè)/mL。培養(yǎng)12 d后，以6000 r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)孔徑為0.45 μm的玻璃纖維素濾膜過(guò)濾得到赤潮異彎藻濾液，然后經(jīng)f/2營(yíng)養(yǎng)鹽加富后作為孔石莼的培養(yǎng)液。取0.05 g孔石莼接種于150 mL f/2培養(yǎng)液中，使其初始接種量達(dá)到0.33 g/L后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.3 孔石莼與赤潮異彎藻間胞內(nèi)物質(zhì)的交叉培養(yǎng)試驗(yàn)

1)孔石莼胞內(nèi)物質(zhì)對(duì)赤潮異彎藻生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)。取孔石莼30 g，加少許消毒海水研磨成漿，以6000 r/min離心10 min后，取上清液0、1、2、4、8 mL分別加入150 mL f/2培養(yǎng)液中，相當(dāng)于培養(yǎng)液中分別含有0(對(duì)照)、3.33、6.67、13.33、26.67 g/L的孔石莼胞內(nèi)物質(zhì)。赤潮異彎藻初始接種密度為1.0萬(wàn)個(gè)/mL，分別接種于含不同接種量的孔石莼胞內(nèi)物質(zhì)的培養(yǎng)液中進(jìn)行試驗(yàn)。

2)赤潮異彎藻胞內(nèi)物質(zhì)對(duì)孔石莼生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)。把培養(yǎng)12 d的赤潮異彎藻溶液以6000 r/min離心10 min，棄上清液，取沉淀的赤潮異彎藻加入消毒海水中，使藻細(xì)胞重懸浮于溶液中。用消毒海水來(lái)調(diào)解藻細(xì)胞的密度，分別為0(對(duì)照)、5.0、10.0、20.0、40.0萬(wàn)個(gè)/mL，然后再使用超聲波使藻細(xì)胞完全破碎。分別取150 mL含不同密度的赤潮異彎藻的破碎液進(jìn)行f/2營(yíng)養(yǎng)鹽加富，各接入0.05 g孔石莼，使其初始接種量達(dá)到0.33 g/L后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.4 孔石莼的稱(chēng)重與赤潮異彎藻細(xì)胞密度的測(cè)定 每3 d取樣進(jìn)行測(cè)定，取樣后每個(gè)培養(yǎng)瓶中補(bǔ)充f/2培養(yǎng)液，以消除可能產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)鹽限制［9］。

用吸水紙把孔石莼表面的水吸干后稱(chēng)重。微藻用Lugol碘液固定，采用平板計(jì)數(shù)法，在Olympus雙筒顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析?？资簧L(zhǎng)的抑制率 (IU)按下式計(jì)算:

其中:Uc為t時(shí)間對(duì)照組孔石莼質(zhì)量 (g);Ut為t時(shí)間處理組的孔石莼質(zhì)量 (g);U0為試驗(yàn)初始孔石莼的質(zhì)量 (g)。

赤潮異彎藻生長(zhǎng)的抑制率 (IH)按下式計(jì)算:

其中:Hc為 t時(shí)間對(duì)照組赤潮異彎藻的密度 (萬(wàn)個(gè)/mL);Ht為t時(shí)間處理組赤潮異彎藻的密度 (萬(wàn)個(gè)/mL);H0為試驗(yàn)初始赤潮異彎藻的密度 (萬(wàn)個(gè)/mL)。

2 結(jié)果

2.1 孔石莼與赤潮異彎藻間的克生作用

2.1.1 孔石莼對(duì)赤潮異彎藻生長(zhǎng)的影響 孔石莼對(duì)赤潮異彎藻的生長(zhǎng)有明顯的影響。從圖1可見(jiàn):試驗(yàn)第6～12天時(shí)，接種孔石莼的4個(gè)處理組赤潮異彎藻的生長(zhǎng)都受到了極顯著的抑制 (P＜0.01);隨著孔石莼初始接種量的增加，抑制作用愈加明顯，第 12天時(shí)，接種量為 0.33、0.67、1.33、2.67 g/L的4組孔石莼對(duì)赤潮異彎藻生長(zhǎng)的抑制率分別為38.9%、70.6%、81.6%、84.%。

2.1.2 赤潮異彎藻對(duì)孔石莼生長(zhǎng)的影響 赤潮異彎藻對(duì)孔石莼的生長(zhǎng)有明顯的影響。從圖2可見(jiàn):試驗(yàn)第9天時(shí)，接種赤潮異彎藻的4個(gè)處理組孔石莼的生長(zhǎng)都受到了極顯著的抑制 (P＜0.01);隨著赤潮異彎藻初始接種密度的增加，抑制作用愈加明顯，第12天時(shí)，接種密度為0.5、1.0萬(wàn)個(gè)/mL的兩組孔石莼的生長(zhǎng)要明顯好于接種密度為4.0萬(wàn)個(gè)/mL的組 (P＜0.01)，接種密度為0.5、1.0、2.0、4.0萬(wàn)個(gè)/mL的4組赤潮異彎藻對(duì)孔石莼生長(zhǎng)的抑制率分別為30.25%、39.64%、49.82%、57.49%。

圖1 不同初始接種量的孔石莼對(duì)赤潮異彎藻生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of U.pertusa with diffierent inoculated initial weights on the growth of H.akashiwo

圖2 不同初始接種密度的赤潮異彎藻對(duì)孔石莼生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of H.akashiwo in diffierent inoculated initial cell density on the growth of U.pertusa

2.2 孔石莼與赤潮異彎藻間的濾液交叉培養(yǎng)試驗(yàn)

2.2.1 孔石莼培養(yǎng)液濾液對(duì)赤潮異彎藻生長(zhǎng)的影響 孔石莼培養(yǎng)液濾液對(duì)赤潮異彎藻生長(zhǎng)有明顯的影響。從圖3可見(jiàn):試驗(yàn)第12天時(shí)，除孔石莼初始接種量為0.33 g/L組外，其它3個(gè)處理組赤潮異彎藻的生長(zhǎng)都受到了極顯著的抑制 (P＜0.01);隨著孔石莼初始接種量的增加，其培養(yǎng)液濾液對(duì)赤潮異彎藻生長(zhǎng)的抑制作用愈加明顯，第12天時(shí)，接種量為0.67、1.33、2.67 g/L的3組孔石莼濾液對(duì)赤潮異彎藻生長(zhǎng)的抑制率分別為8.05%、19.69%、39.73%。

2.2.2 赤潮異彎藻培養(yǎng)液濾液對(duì)孔石莼生長(zhǎng)的影響 不同初始接種密度的赤潮異彎藻培養(yǎng)液濾液對(duì)孔石莼生長(zhǎng)有明顯的影響。從圖4可見(jiàn):隨著赤潮異彎藻初始接種密度的增加，孔石莼生長(zhǎng)受到其培養(yǎng)液濾液的影響增大;第12天時(shí)，接種赤潮異彎藻密度為2.0、4.0萬(wàn)個(gè)/mL的兩組孔石莼的生長(zhǎng)受到了極顯著的抑制 (P＜0.01)，接種密度為0.5、1.0、2.0、4.0萬(wàn)個(gè)/mL的4組赤潮異彎藻濾液對(duì)孔石莼生長(zhǎng)的抑制率分別為1.64%、10.24%、15.97%、19.45%。

圖3 不同初始接種量的孔石莼培養(yǎng)液濾液對(duì)赤潮異彎藻生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effectsofculture medium filtratesfrom U.pertusa with diffierent inoculated initial weights on the growth of H.akashiwo

圖4 不同初始接種密度的赤潮異彎藻培養(yǎng)液濾液對(duì)孔石莼生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effectsofculture medium filtratesfrom H.akashiwo in diffierent inoculated initial cell density on the growth of U.pertusa

2.3 孔石莼與赤潮異彎藻間的胞內(nèi)物質(zhì)交叉培養(yǎng)試驗(yàn)

2.3.1 孔石莼胞內(nèi)物質(zhì)對(duì)赤潮異彎藻生長(zhǎng)的影響不同濃度的孔石莼胞內(nèi)物質(zhì)對(duì)赤潮異彎藻生長(zhǎng)有明顯的影響。從圖5可見(jiàn):第12天時(shí)，接種孔石莼胞內(nèi)物質(zhì)的4個(gè)處理組中，除3.33 g/L組赤潮異彎藻的生長(zhǎng)受到的抑制不顯著外 (P＞0.05)，其它3組均受到了極顯著的抑制 (P＜0.01);隨著孔石莼胞內(nèi)物質(zhì)濃度的增加，胞內(nèi)物質(zhì)對(duì)赤潮異彎藻生長(zhǎng)的抑制作用愈加明顯，第12天時(shí)，濃度為3.33、6.67、13.33、26.67 g/L的4組孔石莼胞內(nèi)物質(zhì)對(duì)赤潮異彎藻生長(zhǎng)的抑制率分別為4.87%、6.35%、44.80%、69.16%。

圖5 不同濃度的孔石莼胞內(nèi)物質(zhì)對(duì)赤潮異彎藻生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effects of intracellular products from U.pertusa at diffierent concentrations on the growth of H.akashiwo

2.3.2 赤潮異彎藻胞內(nèi)物質(zhì)對(duì)孔石莼生長(zhǎng)的影響赤潮異彎藻胞內(nèi)物質(zhì)對(duì)孔石莼生長(zhǎng)的影響亦明顯。從圖6可見(jiàn):赤潮異彎藻初始接種密度越大，其胞內(nèi)物質(zhì)對(duì)孔石莼生長(zhǎng)的影響就越大;第9天時(shí)，赤潮異彎藻胞內(nèi)物質(zhì)濃度為 20.0、40.0萬(wàn)個(gè)/mL的兩組孔石莼的生長(zhǎng)受到了極顯著的抑制 (P＜0.01);第12天時(shí)，赤潮異彎藻胞內(nèi)物質(zhì)濃度為10.0萬(wàn)個(gè)/mL的組孔石莼的生長(zhǎng)也受到了極顯著的抑制 (P＜0.01)，濃度為 5.0、10.0、20.0、40.0萬(wàn)個(gè)/mL的4組赤潮異彎藻胞內(nèi)物質(zhì)對(duì)孔石莼生長(zhǎng)的抑制率分別為8.57%、20.74%、46.76%、56.09%。

3 討論

3.1 孔石莼與赤潮異彎藻間的克生關(guān)系

克生是指一種植物通過(guò)向環(huán)境中釋放某些化學(xué)物質(zhì)，在其周?chē)纬梢粋€(gè)微環(huán)境區(qū)域，從而抑制或促進(jìn)該區(qū)域內(nèi)其它植物生長(zhǎng)的現(xiàn)象［10］。Nan等［11］研究了孔石莼對(duì)8種海洋微藻的克生作用，結(jié)果表明，孔石莼對(duì)海洋微藻的克生效應(yīng)是普遍存在的。已有研究表明，孔石莼對(duì)赤潮異彎藻的生長(zhǎng)存在明顯的抑制作用［1，12］，但海洋微藻對(duì)孔石莼生長(zhǎng)的克生作用卻少見(jiàn)報(bào)道［6］，而赤潮異彎藻對(duì)孔石莼生長(zhǎng)的影響未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)果表明，孔石莼不僅對(duì)赤潮異彎藻的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，赤潮異彎藻對(duì)孔石莼的生長(zhǎng)亦有明顯的抑制作用，隨著赤潮異彎藻初始接種密度的增加，抑制作用愈加明顯，說(shuō)明孔石莼與赤潮異彎藻間存在克生效應(yīng)。

圖6 不同濃度的赤潮異彎藻胞內(nèi)物質(zhì)對(duì)孔石莼生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effects of intracellular products from H.akashiwo at various concentrations on the growth of U.pertusa

3.2 孔石莼與赤潮異彎藻間的相互作用途徑

種群之間的相互作用和相互競(jìng)爭(zhēng)一般通過(guò)兩種方式和途徑進(jìn)行，一種是細(xì)胞的直接接觸抑制，另一種是通過(guò)分泌次生物質(zhì)來(lái)完成對(duì)其它種群的抑制作用［12］。本試驗(yàn)中，孔石莼培養(yǎng)液濾液和胞內(nèi)物質(zhì)對(duì)赤潮異彎藻生長(zhǎng)均有明顯的抑制作用，且隨著孔石莼初始接種量和胞內(nèi)物質(zhì)濃度的增加，對(duì)赤潮異彎藻生長(zhǎng)的抑制作用愈加明顯。這與前人的報(bào)道相似［7，13］。可以推測(cè)，孔石莼可以通過(guò)分泌次生物質(zhì)來(lái)完成對(duì)赤潮異彎藻生長(zhǎng)的抑制，而抑制物質(zhì)存在于藻體和培養(yǎng)液中。微藻培養(yǎng)液濾液和胞內(nèi)物質(zhì)對(duì)孔石莼生長(zhǎng)的影響目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，赤潮異彎藻培養(yǎng)液濾液和胞內(nèi)物質(zhì)對(duì)孔石莼的生長(zhǎng)亦有明顯的抑制作用，且隨著赤潮異彎藻初始接種密度和胞內(nèi)物質(zhì)濃度的增加，對(duì)孔石莼生長(zhǎng)的抑制作用愈加明顯?？梢酝茰y(cè)，赤潮異彎藻也可以通過(guò)分泌次生物質(zhì)來(lái)抑制孔石莼的生長(zhǎng)，而這些抑制物質(zhì)存在于藻體和培養(yǎng)液中。本試驗(yàn)中觀察發(fā)現(xiàn)，赤潮異彎藻全部附著在孔石莼上 (圖7)。顏天等［14］的研究也證明，赤潮異彎藻是通過(guò)細(xì)胞的直接接觸來(lái)抑制其它種群的生長(zhǎng)，所以推測(cè)，赤潮異彎藻對(duì)孔石莼的抑制作用也可能是通過(guò)細(xì)胞的直接接觸完成的。

圖7 附著赤潮異彎藻的孔石莼Fig.7 The U.pertusa attached by H.akashiwo

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