王珊，趙文，焉鴻啟、2

(1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院遼寧省水生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023;2.沈陽(yáng)市水產(chǎn)科學(xué)研究所，遼寧沈陽(yáng)110034)

長(zhǎng)期以來(lái)，褶皺臂尾輪蟲Brachionus plicatilis被認(rèn)為是廣泛分布于內(nèi)陸和沿海咸水水體的單一物種［1］，包括S－型和L－型兩種類型。隨著科學(xué)家對(duì)生物復(fù)合類群研究的深入和分子生物學(xué)手段的介入，他們發(fā)現(xiàn)褶皺臂尾輪蟲應(yīng)該被視為一個(gè)包含隱匿同胞物種的輪蟲復(fù)合類群 (B.plicatilis complex)，其中至少包括3個(gè)物種［2－4］。這一復(fù)合類群可以根據(jù)其主要的進(jìn)化關(guān)系及體型分為三大類群——大型 (L)、中型 (SM)和小型 (SS)。2001年，Ciros－Pérez等［5］分別詳細(xì)描述了這三大類群中3種輪蟲 B.plicatilis Müller、B.ibericus n.sp.和B.rotundiformis Tschugunoff的基本形態(tài)特征、生態(tài)特點(diǎn)和交配行為，并且使用分子生物學(xué)方法確定了其種類。這一復(fù)合類群會(huì)隨著季節(jié)的改變發(fā)生明顯的周期性變形。目前，相關(guān)的研究基本都集中在食物密度對(duì)休眠卵大小的影響上［6－10］，而關(guān)于輪蟲休眠卵的體積隨周圍環(huán)境的變化而發(fā)生改變的研究未見(jiàn)報(bào)道。為了更好地了解輪蟲同胞物種間的生態(tài)差異和季節(jié)變異的機(jī)理，本研究中，作者在新分類標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，研究了不同溫度和鹽度對(duì)褶皺臂尾輪蟲復(fù)合類群中3種同胞物種輪蟲Brachionus plicatilis Müller、B.plicatilis Yamamoto 和 B.rotundiformis Tschugunoff休眠卵體積變化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用褶皺臂尾輪蟲復(fù)合類群采自大連市自然博物館附近的一個(gè)沿海半咸水池塘——明珠花園水池 (體積約8886 m3，鹽度為5)。

1.2 方法

1.2.1 輪蟲的采集和預(yù)培養(yǎng) 試驗(yàn)前，先將輪蟲在光照培養(yǎng)箱 (Thermo－3744，±0.1℃)內(nèi)馴化培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)溫度為20℃，鹽度為5，光周期為12L∶12D，光照強(qiáng)度為2500 lx。培養(yǎng)用水取自黑石礁海區(qū)，經(jīng)煮沸消毒后，用蒸餾水稀釋到需要的鹽度，用VIR－211型鹽度計(jì)在20℃下測(cè)定海水鹽度。每天投喂蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa，每周更換一次培養(yǎng)液。從馴化后的輪蟲中挑選單只輪蟲單獨(dú)培養(yǎng)，使其經(jīng)孤雌生殖形成種群。

1.2.2 種類鑒定 從培養(yǎng)出的每個(gè)輪蟲種群中隨機(jī)挑選出3只帶卵的孤雌生殖個(gè)體，用體積分?jǐn)?shù)為5%的甲醛固定后，在Olympus－CX21顯微鏡下進(jìn)行鏡檢。將具有典型種類特征的3種輪蟲挑選出來(lái)，分別培養(yǎng)，種類鑒定參照前人的標(biāo)準(zhǔn)［5，11－13］。各種輪蟲經(jīng)過(guò)孤雌生殖培育形成群體后，將單只輪蟲饑餓后進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增、COⅠ測(cè)序，參照董云偉等［14］的方法，將測(cè)序結(jié)果與GenBank中已發(fā)表的相關(guān)序列進(jìn)行比較，分別應(yīng)用DNAstar 5.0和ClustalX 1.81進(jìn)行比對(duì)，并確定其種類。擴(kuò)增引物參照Folmer等［15］設(shè)計(jì)的引物，每個(gè)類群的檢測(cè)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.3 溫度和鹽度對(duì)3種輪蟲休眠卵體積的影響試驗(yàn) 隨機(jī)從 3種輪蟲 B.plicatilis Müller、B.plicatilis Yamamoto和B.rotundiformis Tschugunoff(分別簡(jiǎn)稱為Bm、By和Br)中挑選活力強(qiáng)的懷卵非混交雌體放入燒杯中培養(yǎng)，培養(yǎng)液體積為50 mL，每個(gè)燒杯中放25只輪蟲。溫度分別設(shè)為15、20、25℃，每個(gè)溫度下分別設(shè)置3個(gè)鹽度 (5、15、30)。每個(gè)試驗(yàn)設(shè)2個(gè)重復(fù)。

試驗(yàn)在光照培養(yǎng)箱 (Thermo－3744，±0.1℃)中進(jìn)行，光周期為12L∶12D，光照強(qiáng)度為2500 lx，投喂蛋白核小球藻，餌料密度為2×106個(gè)/mL。培養(yǎng)用水取自黑石礁海區(qū)，經(jīng)煮沸消毒后，用蒸餾水稀釋到需要的鹽度。每6 h攪動(dòng)一次培養(yǎng)液，使餌料懸浮有利于輪蟲攝食，每2 d更換一次培養(yǎng)液。試驗(yàn)時(shí)間為15 d，15 d后收集休眠卵。將收集的休眠卵用體積分?jǐn)?shù)為5%的福爾馬林固定，并在Olympus－CH21型顯微鏡 (15×40)下測(cè)量輪蟲的卵長(zhǎng) (L，μm)和卵寬 (W，μm)，每組測(cè)量20個(gè)休眠卵。休眠卵體積 (V，μm3)按照以下公式計(jì)算［7］:

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 11.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和三因素方差分析，用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 種類鑒定

對(duì)3種輪蟲形態(tài)學(xué)的測(cè)量結(jié)果表明:Bm的平均被甲長(zhǎng)和被甲寬分別為270.90、219.80 μm，By的平均被甲長(zhǎng)和被甲寬分別為269.20、205.95 μm，相似的同胞物種Bm的體型比By稍大;Br的體型最小，平均被甲長(zhǎng)和被甲寬分別為153.08、124.81 μm。對(duì)3種輪蟲的被甲長(zhǎng)和被甲寬進(jìn)行方差分析后可知，3種輪蟲之間存在極顯著差異 (n=25，P＜ 0.01)。

將通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定為 B.plicatilis Müller、B.plicatilis Yamamoto和B.rotundiformis Tschugunoff的線粒體COⅠ序列在GeneBank中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):Bm的COⅠ區(qū)序列與AY785178(Brachionus plicatilis isolate tianjin4)和AP009408(Brachionus plicatilis mitochondrial)DNA的COⅠ區(qū)序列覆蓋率和相似度都為100%，說(shuō)明該種輪蟲確為B.plicatilis Müller;By的COⅠ區(qū)序列和AP009408(Brachionus plicatilis mitochondrial)的COⅠ區(qū)序列覆蓋率為97%，相似度為98%，說(shuō)明該種輪蟲為B.plicatilis Müller的同胞物種;Br的COⅠ區(qū)序列和AY785225的COⅠ區(qū)序列覆蓋率和相似度均為100%，說(shuō)明該種輪蟲確為B.rotundiformis Tschugunoff。

2.2 休眠卵體積

將3種輪蟲的休眠卵體積進(jìn)行三因素方差分析(tree－way ANOVA)和多重比較，結(jié)果表明，溫度、鹽度、種類及溫度與鹽度的交互作用對(duì)輪蟲休眠卵的體積影響均極顯著 (P＜0.001)。

從表1可見(jiàn):在各種溫度和鹽度條件下，Br休眠卵的體積均顯著小于另外兩種輪蟲同胞物種Bm和By(P＜0.05)，而這兩種體型相近的輪蟲Bm和By休眠卵的體積只在高溫低鹽 (25℃，5)、高溫中鹽 (25℃，15)、中溫中鹽 (20℃，15)和中溫高鹽 (20℃，30)的條件下差異顯著(P＜0.05)。Br休眠卵的平均體積為 3.68×105μm3，而Bm和By休眠卵的平均體積分別為10.88×105μm3和10.69×105μm3。3 種輪蟲中，休眠卵平均體積最小的是Br，為2.99×105μm3，出現(xiàn)在低溫高鹽 (15℃，30)條件下;休眠卵平均體積最大的是By，為13.23×105μm3，出現(xiàn)在低溫低鹽(15℃，5)條件下。

當(dāng)溫度為15～25℃時(shí)，Br和Bm的休眠卵體積在各鹽度下均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，而By的休眠卵體積則呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢(shì)。當(dāng)鹽度為5～30時(shí)，3種輪蟲休眠卵體積在各溫度下呈現(xiàn)的變化規(guī)律不太一致，總體上呈下降的趨勢(shì)。

各溫度條件下，Bm和By休眠卵的體積差異顯著 (P＜0.05)。在中溫條件下，Br的休眠卵體積比其它溫度條件變化顯著 (P＜0.05)，而低溫和高溫條件下的Br休眠卵體積之間變化不顯著 (P＞0.05)。

在低鹽條件下，Bm和By的休眠卵體積比其它鹽度條件變化顯著 (P＜0.05);在高鹽條件下，Br的休眠卵體積比其它鹽度條件變化顯著 (P＜0.05)。

表1 不同溫度和鹽度下3種輪蟲休眠卵的體積Tab.1 The resting egg volume of three rotifer species at different temperatures and salinity 105μm3

3 討論

本研究中鑒定出的Bm和By在基因和表型上都具有很大的相似性，在低溫 (15℃)條件下這兩種輪蟲休眠卵的體積差異并不顯著，可能與它們?cè)诘蜏貤l件下基礎(chǔ)代謝降低有關(guān)。但在溫度較高的條件下，兩種輪蟲休眠卵的體積卻表現(xiàn)出了不同的變化規(guī)律，說(shuō)明微小的基因差異就有可能導(dǎo)致其在不同環(huán)境條件下產(chǎn)生不同的變化。溫度、鹽度及其交互作用對(duì)這兩種相似的同胞物種休眠卵的體積影響顯著 (P＜0.05)，其中鹽度和溫度與鹽度的交互作用對(duì)其影響極顯著 (P＜0.01)，說(shuō)明對(duì)于這兩種L－型輪蟲來(lái)說(shuō)，休眠卵體積對(duì)鹽度的改變較溫度更為敏感，這與它們生活的半咸水池塘的鹽度常年保持在5有關(guān)。

自然條件下，同一水域分布的輪蟲休眠卵的體積會(huì)有很大差異［16］，且沉積在自然水域底泥中的褶皺臂尾輪蟲休眠卵體積大小會(huì)隨著底泥垂直分層的不同而不同［17］。這種現(xiàn)象可能與環(huán)境因子對(duì)輪蟲休眠卵體積的影響有關(guān)。為了探究這一現(xiàn)象，人們研究了不同溫度和鹽度條件下輪蟲休眠卵的變化，結(jié)果表明，在極端的溫度和鹽度條件下，褶皺臂尾輪蟲的休眠卵體積會(huì)較大［18］;Pavón－Meza等［19］在對(duì)輪蟲Brachionus havanaensis的研究中也證明休眠卵體積與輪蟲體型呈線形相關(guān)。本研究中，Bm和By的休眠卵體積在各個(gè)溫度和鹽度條件下都明顯大于Br休眠卵的體積，這與此3種輪蟲的個(gè)體大小是緊密相關(guān)的:Br本身屬于S－型輪蟲，而Bm和By則屬于L－型輪蟲。本研究中，最大的平均休眠卵體積出現(xiàn)在低溫低鹽 (15℃，5)條件下，而在此條件下Bm和By休眠卵的體積偏大(表1)。由于Br對(duì)低溫 (15℃)不適應(yīng)性，這種輪蟲在低溫條件下沒(méi)有表現(xiàn)出這一特點(diǎn)，但在相對(duì)適應(yīng)的溫度和鹽度條件下——中溫低鹽 (20℃，5)，該輪蟲休眠卵體積最大。這說(shuō)明盡管在極端溫度和鹽度條件下輪蟲休眠卵的體積會(huì)有所變化，但較大的休眠卵只會(huì)出現(xiàn)在該種輪蟲較為適應(yīng)的環(huán)境中。

［1］Walker K F.A synopsis of ecological information on the saline lake rotifer Brachionus plicatilis Müller 1786［J］.Hydrobiologia，1981，81－82:159－167.

［2］Gómez á，Temprano M，Serra M.Ecological genetics of a cyclical parthenogen in temporary habitats［J］.Journal of Evolutionary Biology，1995，8(5):601－622.

［3］Gómez á，Serra M.Behavioral reproductive isolation among sympatric strains of Brachionus plicatilis Müller 1786 insights into the status of this taxonomic species［J］.Hydrobiologia，1995，313 －314:111－119.

［4］Gómez á，Snell T W.Sibling species and cryptic speciation in the Brachionus plicatilis species complex(Rotifera)［J］.Journal of Evolutionary Biology，1996，9(6):953－964.

［5］Ciros－Pérez J，Gómez á，Serra M.On the taxonomy of three sympatric sibling species of the Brachionus plicatilis(Rotifera)complex from Spain，with the description of B.ibericusn sp.［J］.Journal of Plankton Research，2001，23(12):1311－1328.

［6］Kirk K L.Egg size，offspring quality and food level in planktonic rotifers［J］.Freshwater Biology，1997，37:515－521.

［7］Sarma S S S，Rao T R.Effect of food level on body size and egg size in a growing population of the rotifer Brachionus patulus Müller［J］.Archivfür Hydrobiologie，1987，111:245－253.

［8］Walz N，Rothbucher F.Effect of food concentration on body size，egg size and population dynamics of Brachionus angularis(Rotatoria)［J］.Verhandlungen des Internationalen Verein Limnologie，1991，24:2750－2753.

［9］胡好遠(yuǎn)，席貽龍，耿紅.食物濃度對(duì)角突臂尾輪蟲種群增長(zhǎng)、個(gè)體大小和卵大小的影響［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2002，13(7):875－878.

［10］耿紅，席貽龍，胡好遠(yuǎn).食物種類和濃度對(duì)紅臂尾輪蟲種群增長(zhǎng)、個(gè)體大小及卵大小的影響［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2003，14(5):573－576.

［11］Sudzuki M.Intraspecific variability of Brachionus plicatilis［J］.Hydrobiologia，1987，147:45－47.

［12］Segers H.Nomenclatural consequences of some recent studies on-Brachionus plicatilis(Rotifera，Brachionidae)［J］.Hydrobiologia，1995，313－314:121－122.

［13］殷旭旺，趙文.沿海混鹽水體褶皺臂尾輪蟲的復(fù)合類群及其種群動(dòng)態(tài)［J］.大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，20(1):1－10.

［14］董云偉，牛翠娟，鮑蕾，等.單只輪蟲 DNA提取及其細(xì)胞色素C氧化酶:I亞基部分序列測(cè)定［J］.動(dòng)物學(xué)研究，2002，23(1):81－83.

［15］Folmer M，Black W，Hoeh R，et al.DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrate［J］.Molecular Marine Biology and Biotechnology，1994，9:294－299.

［16］Gilbert J J.Dormancy in rotifers［J］.Transactions of the American Microscopical Society，1974，93:490－513.

［17］Snell T W，Burke B E，Messur S D.Size and distribution of resting eggs in a natural population of the rotifer Brachionus plicatilis［J］.Gulf Research Reports，1983，7(3):285－287.

［18］Serrano L，Serra M，Miracle M R.Size variation in Brachionus plicatilis resting eggs［J］.Hydrobiologia，1989:186－187:381－386.

［19］Pavón－Meza E L，Sarma S S S，Nandini S.Combined effects of temperature，food(Chlorella vulgaris)concentration and predation(Asplanchna girodi)on the morphology of Brachionus havanaensis(Rotifera)［J］.Hydrobiologia，2007，593(1):95－101.