黃 媚 劉喜華

1黃媚（1979.8—），女，助理工程師，主要從事制劑開(kāi)發(fā)和檢驗(yàn)工作，廣西梧州制藥集團(tuán)（股份）有限公司 廣西梧州 543002 2 廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院 廣西南寧 543002

復(fù)方菊陳顆粒是由菊花等多味中藥組成的復(fù)方制劑，具有散風(fēng)清熱、燥濕健脾等功效，可用于風(fēng)熱感冒、厭食口膩等癥狀，臨床上還將其用于解酒、醒酒等方面。本實(shí)驗(yàn)以菊花中的綠原酸為控制指標(biāo)，采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)成品進(jìn)行質(zhì)量控制。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；Ultimate XB-C18（月旭材料科技（上海）有限公司，4.6×250mm，5μm）；BS224S電子天平（北京賽多利斯）；LG-16WA臺(tái)式高速離心儀（北京京立離心機(jī)有限公司）；SB5200DT超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試藥

綠原酸對(duì)照品，供含量測(cè)定用，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為：110753-200413；甲醇、乙腈（美國(guó)fisher公司，色譜醇）；娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；其它試劑為分析純；復(fù)方菊陳顆粒三批（本公司自行研制，批號(hào)：110901、110902、110903）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，按以下條件和方法進(jìn)行。色 譜 柱：Ultimate C18柱（4.6×250mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸梯度洗脫（詳見(jiàn)表1）；流速：1.0mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：328nm；柱溫：300；進(jìn)樣量：10μL；理論塔板數(shù)計(jì)算應(yīng)不少于7500[1-3]。分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：供試品溶液中綠原酸能與相鄰組分峰分離，分離度R＞1.5，陰性對(duì)照品溶液無(wú)干擾，色譜圖見(jiàn)圖1-3。

表1 綠原酸含測(cè)梯度洗脫程序（后運(yùn)行時(shí)間：10min）

圖1 綠原酸對(duì)照品色譜圖（a為綠原酸）

圖2 供試品色譜圖（a為綠原酸）

圖3 陰性樣品色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取低溫真空干燥至恒重的綠原酸對(duì)照品適量，加甲醇至溶解制成每1ml中含33.04μg綠原酸對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

取樣品研細(xì)1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇20ml，稱定重量，超聲提取60min，放冷至室溫，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，過(guò)0.45μm微孔濾膜即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備

按處方比例配制成不含菊花的陰性樣品，并按2.2.2項(xiàng)下方法制成陰性樣品溶液。

2.3 線性關(guān)系考察

精密稱取綠原酸對(duì)照品4.13mg置于25m1容量瓶中，加甲醇溶解，并定容至刻度，制成濃度為165.2μg/ml的綠原酸對(duì)照品溶液，然后分別稀釋成 82.6、33.04、16.52、6.608μg/ml。按上述色譜條件，分別吸取這5個(gè)對(duì)照品溶液10μl進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算得回歸方程為Y=23.818X-63.398，r=0.9998。結(jié)果表明，綠原酸在進(jìn)樣量為0.066μg～1.652μg線性良好。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取濃度為33.04μg/ml的綠原酸對(duì)照品溶液10μ1，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定綠原酸峰面積，RSD值僅為0.39%，表明儀器的精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別在制備后0，2，4，6，8，10，12h精密吸取10μl進(jìn)樣，記錄每次進(jìn)樣綠原酸峰面積，RSD值為2.06%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（110901）6份，按供試品溶液的制備方法制備，進(jìn)樣10μl，測(cè)定峰面積。計(jì)算綠原酸含量。綠原酸平均含量為0.3820mg·g-1，RSD值為2.29%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取已測(cè)得綠原酸含量的樣品(110901)6份，每份1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入一定量的綠原酸對(duì)照品，按2.2.2項(xiàng)下的方法制備供試品，在上述色譜條件下依法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 綠原酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.8 樣品測(cè)定

取三批樣品研細(xì)，取1g，精密稱定，按2.2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液和樣品溶液各10μ1，注入液相色圖譜儀，測(cè)定綠原酸峰面積，外標(biāo)法計(jì)算綠原酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。表中RSD值為0.04%，表明三批樣品綠原酸含量穩(wěn)定。

表3 樣品綠原酸含量測(cè)定

3 討論

3.1 預(yù)實(shí)驗(yàn)曾對(duì)綠原酸采用了高效液相的等度洗脫，但在連續(xù)注入數(shù)個(gè)樣品之后，后期色譜圖基線出現(xiàn)了極大的波動(dòng)，可能為低極性物質(zhì)保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致，于是將綠原酸的測(cè)定改為梯度洗脫，使低極性物質(zhì)不影響綠原酸的測(cè)定，同時(shí)節(jié)省分析時(shí)間。

3.2 供試品中的綠原酸進(jìn)行DAD掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在328nm處有最大吸收，故確定其作為檢測(cè)波長(zhǎng)。同時(shí)對(duì)供試品制備方法進(jìn)行了提取溶劑、提取方法、提取時(shí)間的考察，結(jié)果表明：甲醇提取的綠原酸比水及乙醇提取的更充分；超聲提取比回流提取及索氏提取的更完全；30min、60min、90min提取以60min提取的含量最高，故供試品制備方法按上述最佳條件進(jìn)行。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010:292.

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[3]吳懷恩，勞深，王雯慧，等.HPLC測(cè)定石韋配方顆粒中綠原酸、咖啡酸及芒果苷的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010,16(16):54-61.