李惠玲

斑馬魚(Danio reio，舊稱Brachydanio reirio)，俗稱“zebra fish”或者“zebrafish”，屬硬骨魚類，輻鰭綱(Actinopterygii)，鯉形目(Cypriniformes)，鯉科(Cyprinidae)短擔(dān)尼魚屬(Danio)。原產(chǎn)印度，是一種性情溫和、雜食性的淡水魚［1］。斑馬魚約有10余個(gè)品系，目前研究中常用的有源于德國(guó)的Tübingen和源于美國(guó)的AB兩個(gè)品系。斑馬魚體呈梭型，個(gè)體長(zhǎng)約5 cm左右，喂養(yǎng)簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)成本低，容易大規(guī)模飼養(yǎng)。斑馬魚生長(zhǎng)周期短，3個(gè)月就可以性成熟。雌魚每周個(gè)產(chǎn)卵一次，每次幾百枚不等。斑馬魚的胚胎發(fā)育在體外完成，并且透明可見，胚胎時(shí)期血管走向清晰，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，這使得研究者能從完整的活體觀察到心血管系統(tǒng)發(fā)育情況和血液循環(huán)，甚至可以觀察到基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)情況，避免了殺死或解剖動(dòng)物，非常適合用于血管發(fā)生的研究。

血管新生是促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和進(jìn)展的因素之一，同時(shí)也是治療缺血性疾病的關(guān)鍵。然而影響血管新生的因素有很多，包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受體家族(VEGF receptor)、血管生成素及其受體Tic家族和重組堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast grouth factor，bFGF)對(duì)血管的新生和發(fā)育起著相當(dāng)重要的作用。然而，現(xiàn)在對(duì)促血管生成的中藥研究和應(yīng)用還比較少。麝香保心丸是中藥治療冠心病的代表藥之一，臨床實(shí)踐和藥理研究證明麝香保心丸有顯著的抗心肌缺血作用［2］，但對(duì)其在缺血心臟冠脈側(cè)枝血管生成方面的作用機(jī)制尚未清楚，本實(shí)驗(yàn)通過觀察麝香保心丸對(duì)斑馬魚模型血管新生影響，探討麝香保心丸促血管生成的效應(yīng)，為進(jìn)一步研究其在改善缺血心臟側(cè)枝循環(huán)方面的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 斑馬魚胚胎的準(zhǔn)備 實(shí)驗(yàn)斑馬魚為AB系普通斑馬魚和血管熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Flk-1)，取自美國(guó)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院。根據(jù)Westerfield［3］的方法進(jìn)行養(yǎng)殖和繁殖，雌雄分開喂養(yǎng)于(28.5±1)℃的環(huán)境中，使用自動(dòng)計(jì)時(shí)器保持14 h光照/10 h黑暗交替循環(huán)，每日分三次定時(shí)喂以豐年蝦(brine shrimp)。養(yǎng)魚系統(tǒng)中使用日夜循環(huán)水，每天補(bǔ)充10%新鮮去離子水。

參照斑馬魚手冊(cè)［4］闡述的方法，將健康成熟的斑馬魚按雌雄1/2的比例放入交配魚缸中，次日搜集雄魚雌魚交配產(chǎn)下的受精胚胎。每次試驗(yàn)設(shè)置4～5對(duì)斑馬魚交配，平均每對(duì)魚能夠產(chǎn)下100～150個(gè)受精胚胎，斑馬魚胚胎培養(yǎng)在胚胎水中(0.2 g/L的即溶海鹽水溶液)，放于28.5℃的孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)大約20 h(21個(gè)體節(jié)階段)后挑出健康的胚胎，用1 mg/ml的蛋白酶(Sigma，p5459)水解去卵膜，再放入胚胎水中浸泡洗滌5 min。將胚胎隨機(jī)分組后培養(yǎng)到96孔板中，每組設(shè)6個(gè)副孔，每孔放3個(gè)，每孔加入200 μL胚胎水。因?yàn)榘唏R魚胚胎可以從卵黃球里汲取營(yíng)養(yǎng)，所以在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程都不要給予營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充。

1.2 藥物的配制和加入 取1 g麝香保心丸(購(gòu)于上海和黃藥業(yè)有限公司)溶于20 ml蒸餾水中(50 g/L)，37℃攪拌成混懸液，再分別胚胎水稀釋成25 g/L，12.5 g/L，和6.25 g/L，離心后取上清，用0.22 μm的濾頭過濾滅菌。bFGF購(gòu)于武漢人禾醫(yī)藥有限公司，用0.22 μm微孔濾膜過濾載體，高溫蒸汽滅菌后待用。選擇受精20 h(hours post fertilization，h pf)的斑馬魚胚胎，將不同濃度的麝香保心丸按組別加入到斑馬魚的培養(yǎng)基中，每孔 20 μL，陽(yáng)性對(duì)照組每孔加入 50 μL bFGF，陰性對(duì)照組每孔加入20 μL 0.9%的生理鹽水。然后將斑馬魚胚胎置于28.5℃的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h.

1.3 結(jié)果觀察和處理 斑馬魚胚胎發(fā)育到72 h pf時(shí)，吸出培養(yǎng)基，加入200 μL 4%的多聚甲醛PBS(pH=7.4)溶液，室溫靜置10 min后將斑馬魚置于凹槽載玻片里，在體系顯微鏡(Nikon AZ100)下觀察拍照。為了使斑馬魚側(cè)躺在載玻片里，方便觀察腸下血管網(wǎng)絡(luò)，盡量吸干載玻片上的固定液。因?yàn)榘唏R魚的卵黃球是一個(gè)充滿液體的圓形結(jié)構(gòu)，不同局部對(duì)光的反射程度不一樣，所以在觀察過程在卵黃球里的血管網(wǎng)會(huì)出現(xiàn)部分不清晰的情況，為了能夠全面地觀察和拍攝到腸清晰的下血管網(wǎng)絡(luò)，可以從斑馬魚與載玻片接觸的這一面進(jìn)行觀察和拍照，由于卵黃球受到載玻片的擠壓，呈扁平狀，有利于觀察拍照。

選擇20×20倍數(shù)對(duì)斑馬魚腸下血管進(jìn)行拍照，使用NIH Image圖像處理軟件 (由美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院(US National Institutes of Health)研發(fā)，http://rsb.info.nih.gov/nih-image/)對(duì)血管長(zhǎng)度進(jìn)行定量計(jì)算;使用Image-pro-plus 6.0對(duì)血管面積進(jìn)行定量分析。通過使用這兩款軟件的點(diǎn)對(duì)點(diǎn)計(jì)算方法，可以實(shí)現(xiàn)血管總長(zhǎng)度計(jì)算、血管網(wǎng)的延伸長(zhǎng)度計(jì)算以及血管面積計(jì)算［5］。

2 結(jié)果

麝香保心丸組對(duì)雞胚血管生成有明顯促進(jìn)作用。如圖1所示，在顯微鏡下可觀察到實(shí)驗(yàn)組(圖1.B，D)比空白對(duì)照組(圖1.C)和陽(yáng)性對(duì)照組(圖1.A)的血管明顯增多，分支增多，血管面積和直徑增大。實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組均可見釘凸樣血管新生現(xiàn)象(圖1.A，B的箭頭處)空白組的血管保持正常生長(zhǎng)，整體分布均勻。陽(yáng)性對(duì)照組的血管面積較實(shí)驗(yàn)組大，但比陰性對(duì)照組要小。對(duì)血管面積和血管整體長(zhǎng)度進(jìn)行計(jì)算后作圖實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＊＊WTBX?P＜0.01，*P＜0.05)，其中麝香保心丸50 g/L組整體血管長(zhǎng)度為1132.70 μm，血管面積為16089.50像素;陽(yáng)性對(duì)照組血管長(zhǎng)度為869.02 μm，血管面積為12164.5像素。見圖2。

圖1 麝香保心丸對(duì)斑馬魚腸下血管新生的影響

將藥物加入到斑馬魚胚胎培養(yǎng)基中，72 h pf時(shí)期觀察拍照，與對(duì)照組(A和C)相比，實(shí)驗(yàn)組(B和D)表現(xiàn)出了明顯的血管新生作用，分支明顯增多(B)，血管整體面積增大(D)，有釘凸樣生成(箭頭處)。

圖2 麝香保心丸對(duì)斑馬魚腸下血管整體長(zhǎng)度和面積的影響

將藥物加入到斑馬魚胚胎培養(yǎng)基中，72 h pf時(shí)期觀察拍照，使用NIH image軟件對(duì)血管長(zhǎng)度進(jìn)行點(diǎn)對(duì)點(diǎn)計(jì)算(A)，使用image-pro plus對(duì)血管面積進(jìn)行定量分析(B)。

實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組相比較，＊＊P＜0.01，*P＜0.05。

3 討論

最近20年，由于腫瘤疾病和缺血性疾病患者的死亡率在不斷升高，對(duì)血管新生機(jī)制的研究成為了熱點(diǎn)，催生了很多用于血管新生研究的動(dòng)物模型，包括常用的SD大鼠、雞胚絨毛尿囊膜和斑馬魚。由于斑馬魚和人類在血管發(fā)育過程中的基因、信號(hào)通路有高度同源性，結(jié)構(gòu)、生理、分子水平等方面也都很接近。而且與大鼠、雞胚動(dòng)物模型相比，斑馬魚具有成本低、飼養(yǎng)條件要求低、個(gè)體小適合高通量化學(xué)篩選、幼魚身體透明易于觀察血管發(fā)育的特點(diǎn)，所以我們選擇斑馬魚作為血管新生的動(dòng)物模型。

斑馬魚發(fā)育到15個(gè)體節(jié)時(shí)，側(cè)板中胚層的成血管細(xì)胞遷移到中線聚集形成軸向血管(axial vessels，AV)、背動(dòng)脈(dorsal aorta，DA)和后主靜脈(posterior cardinal vein，PCV)。24 h pf心臟開始跳動(dòng)，動(dòng)靜脈相互融合形成一個(gè)單一的閉合循環(huán)回路，血液越過卵黃囊通過居維葉管(ducts of cuvier，DC)開始循環(huán)，即血液循環(huán)開始［6］。斑馬魚胚胎發(fā)育到72 h pf時(shí)，功能性血管開始形成，包括主干血管(major trunk vessels)和新生血管，比如腸下血管網(wǎng)(subintestinal vessels，SIVs)。血管的發(fā)育包括兩過主要過程，一個(gè)是血管發(fā)生(vasculogenesis)，第一個(gè)過程是血管充無到有的一個(gè)過程;第二個(gè)是血管生成，也稱血管新生(angiogenesis)，這是從原有血管上新生出毛細(xì)血管的過程，在這個(gè)過程部分成血管血液祖細(xì)胞會(huì)特化成成血管細(xì)胞［7］。常常在血管發(fā)生的階段完成的時(shí)候進(jìn)行血管新生的干預(yù)，在20 h pf這個(gè)時(shí)期，主干血管已經(jīng)形成，新生血管還未出現(xiàn)，第21個(gè)體節(jié)還未發(fā)育，斑馬魚胚胎還未能活動(dòng)，這一個(gè)發(fā)育階段和外觀形態(tài)通常作為干預(yù)時(shí)刻的標(biāo)準(zhǔn)。所以我們選擇在20 h pf對(duì)斑馬魚的血管新生進(jìn)行干預(yù)，

對(duì)血管新生的干預(yù)方法有很多，根據(jù)藥物的不同性質(zhì)和作用途徑來選擇。常用的方法主要有:①利用顯微注射技術(shù)，將藥物注射到卵黃球(yolk ball)或者卵黃和周皮(periderm)之間，又稱卵周間隙(perivitelline space)。通常藥物的劑量選擇在1～5 μL之間。②直接加入到斑馬魚胚胎的培養(yǎng)基中。該方法直接將干預(yù)藥物加入斑馬魚的培養(yǎng)容器中，或者使用斑馬魚胚胎培養(yǎng)基來稀釋藥物，然后加入到斑馬魚的容器中與斑馬魚共培養(yǎng)。這種方法簡(jiǎn)單易行，定量準(zhǔn)確，對(duì)斑馬魚胚胎損傷較小，基于此，我們選擇直接將麝香保心丸加入到斑馬魚胚胎的培養(yǎng)基中。

為了能夠獲得較為清晰的腸下血管照片，要求斑馬魚在拍照過程中能夠固定不動(dòng)，然而對(duì)斑馬魚的固定方法有很多種，其中Leclair等［8］將2%的凝膠溶解后，放到37℃水浴鍋中保持液體狀態(tài)，然后用該液態(tài)凝膠將斑馬魚固定在某個(gè)透明的小槽里面，可以避免斑馬魚在載玻片里游動(dòng)。很多研究里使用了Zamboni固定液(40 g多聚甲醛溶解在1000 ml含500 ml 0.02 M PBS和150 ml飽和苦味酸水溶液的蒸餾水中)［9，10］。使用Zamboni固定液時(shí)，通常需要提前 24 h 加入固定液，即是在72 h pf時(shí)加入，24 h后再對(duì)斑馬魚進(jìn)行觀察和拍照。由于使用低熔點(diǎn)瓊脂糖會(huì)增加較多的工作量，使用Zamboni固定液需要的時(shí)間較長(zhǎng)，而單純使用4%的多聚甲醛PBS(pH=7.4)溶液做固定液時(shí)，只需要提前6～10 min進(jìn)行固定，較為方便［11］。因此我們選擇多聚甲醛作為斑馬魚的固定液。

斑馬魚的血管新生的形態(tài)學(xué)特征主要從腸下血管網(wǎng)去判斷，腸下血管一般呈籃子(basket)形狀，從體節(jié)的腹部邊緣往卵黃方向延伸，一般長(zhǎng)50～100 μm，斑馬魚的血管新生主要從以下四個(gè)方面去定義［5］:①腸下血管網(wǎng)長(zhǎng)度超過150 μm。②血管網(wǎng)的整體面積增大。③腸下血管的直徑增大。④血管籃子底部有倒釘突樣血管生成(圖1 A，B箭頭處)。其中每一個(gè)新生特征都可以使用NIH Image和Image-pro-plus圖像處理軟件進(jìn)行定量分析［12-15］。

麝香保心丸是治療冠心病的代表性中藥之一，具有較明顯的促血管生成活性，汪姍姍等［16］將麝香保心丸用于體內(nèi)能促進(jìn)CAM血管生成的研究和在體外微血管內(nèi)皮細(xì)胞(microvascularendothelialcells)的增殖研究，麝香保心丸明顯地促進(jìn)CAM血管的生成，并且在體外能夠促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增值并形成管腔結(jié)構(gòu)。麝香保心丸也曾用于犬、大鼠和家兔的心梗治療研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明麝香保心丸縮小了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的心肌梗死范圍，改善了由心肌缺血引起的心梗癥狀［17］。麝香保心丸促血管生成的機(jī)理可能與其促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)bFGF和VEGF mRNA并釋放bFGF和GFP有關(guān)。這一結(jié)果是對(duì)其以往藥理研究成果的重要補(bǔ)充，為它用于冠心病的治療提供了有利依據(jù)［16］。從我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可以看出，麝香保心丸在斑馬魚模型中表現(xiàn)出了明顯的促血管生成作用，并且促進(jìn)作用與藥物的濃度有關(guān)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，斑馬魚腸下血管的分支增多，釘突樣血管明顯，這能夠說明麝香保心丸增加了斑馬魚腸下血管的側(cè)枝循環(huán)，但是這個(gè)離我們的臨床應(yīng)用還有很大距離，為了闡明麝香保心丸在動(dòng)物心梗模型中的作用機(jī)理，我們計(jì)劃做心梗模型實(shí)驗(yàn)和臨床研究做進(jìn)一步的機(jī)理探討。

總之，在本實(shí)驗(yàn)研究中，我們使用斑馬魚模型初步證實(shí)了麝香保心丸有明顯的促血管生成作用。從另一個(gè)層面闡明了麝香保心丸作為一種冠心病治療藥物具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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