劉華金，易有金,*，楊建奎，鐘英麗，陳 雪

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，湖南 長沙 410128；4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

轉(zhuǎn)化白藜蘆醇苷虎杖內(nèi)生真菌的分離和鑒定

劉華金1,2，易有金1,2,*，楊建奎3，鐘英麗4，陳 雪1,2

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，湖南 長沙 410128；4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

為提高虎杖中白藜蘆醇得率，采用虎杖內(nèi)生真菌直接發(fā)酵虎杖轉(zhuǎn)化白藜蘆醇苷為白藜蘆醇，通過從虎杖根、莖中初篩得到6株內(nèi)生真菌，復(fù)篩以虎杖煮提液為底物發(fā)酵，采用高效液相色譜法定量檢測發(fā)酵液中白藜蘆醇苷和白藜蘆醇含量。結(jié)果表明：6株內(nèi)生真菌均具有轉(zhuǎn)化白藜蘆醇苷為白藜蘆醇能力，其中分離于莖內(nèi)的J1轉(zhuǎn)化率最高為25.6%。J1經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及ITS-5.8S rDNA序列分析，鑒定為草酸青霉Penicillium oχalicum，Genbank登錄號為HQ732137。

虎杖；白藜蘆醇苷；白藜蘆醇；內(nèi)生真菌；分離；鑒定

虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.)中白黎蘆醇(resveratrol，RES)是一種天然活性多酚化合物，具有抑制腫瘤[1]、保護心血管[2]、抗氧化、抗自由基等作用，它已被列為抗心血管病、抗癌最有前途的藥物之一[3-4]，是繼紫杉醇之后又一綠色抗癌物質(zhì)。虎杖中白藜蘆醇往往以白藜蘆醇苷(polydatin，PD)的形式存在，干燥虎杖根莖中白藜蘆醇含量僅為0.2%左右，而白藜蘆醇苷含量可達2%[5]。

目前采取化學(xué)方法直接從虎杖中提取白藜蘆醇費時、費力且浪費資源，而有機合成白藜蘆醇反應(yīng)產(chǎn)率低，合成中所用催化劑和反應(yīng)劑均有一定環(huán)境危害性，微生物轉(zhuǎn)化法能克服以上方法不足，且反應(yīng)條件溫和、無污染，微生物轉(zhuǎn)化虎杖已成為生產(chǎn)天然白藜蘆醇研究趨勢之一，如龔云杰等[6]報道從發(fā)酵食品分離一株黑曲霉菌固體堆積發(fā)酵虎杖根莖，袁潤蕾等[7]報道從自然界分離一株根霉菌對白藜蘆醇苷粗提物進行液態(tài)發(fā)酵，雖均可提高虎杖白藜蘆醇得率，但菌種篩選過程有一定盲目性。植物內(nèi)生真菌因其生境獨特，相對于其他微生物資源在微生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域更具目的性和選擇性[8-9]，至今國內(nèi)外關(guān)于虎杖內(nèi)生真菌對白藜蘆醇苷進行轉(zhuǎn)化未見報道；國內(nèi)有關(guān)于從虎杖組織中分離內(nèi)生真菌B-39[10]、Fusarium verticillioides[11]，因其不以虎杖為發(fā)酵底物，直接生產(chǎn)白藜蘆醇，故白藜蘆醇產(chǎn)量較低。本研究擬從新鮮虎杖組織中分離內(nèi)生真菌，篩選直接以虎杖煮提液為底物，轉(zhuǎn)化其白藜蘆醇苷為白藜蘆醇的優(yōu)良內(nèi)生真菌，為今后內(nèi)生真菌直接轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生虎杖采自湖南省漣源市田心坪村；虎杖飲片購自長沙藥材市場。

白藜蘆醇苷、白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品 中國食品藥品檢定研究所；甲醇(色譜級) 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 培養(yǎng)基

菌種篩選培養(yǎng)基[12]：初篩培養(yǎng)基：MgSO40.5g、NaNO35g、FeSO40.01g、KH2PO41g、瓊脂18g，加10g/100mL虎杖煮提液至1L，pH值自然；復(fù)篩培養(yǎng)基：10g/100mL虎杖煮提液，pH值自然。

菌落培養(yǎng)培養(yǎng)基[13]：查氏酵母膏瓊脂培養(yǎng)基(CYA)、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(M EA)、甘油硝酸鹽瓊脂培養(yǎng)基(G25N)、察氏培養(yǎng)基(CA)和馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)。

1.3 儀器與設(shè)備

Agilent 1100高效液相色譜儀(四元泵、在線脫氣機、柱溫箱、VWD檢測器、Chemistation System工作站) 美國Agilent公司；生化培養(yǎng)箱 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；高速冷凍離心機 長沙英泰儀器有限公司；PCR儀 杭州博日科技有限公司；電泳儀 北京六一儀器廠；Gel Logic 212型凝膠成像系統(tǒng) 美國柯達公司。

1.4 具有轉(zhuǎn)化能力虎杖內(nèi)生真菌初篩

采集野生虎杖植株取根、莖桿，表面消毒方法參照文獻[14]，去除根、莖桿韌皮部，取木質(zhì)部用無菌剪刀剪成0.5cm×0.5cm小塊，無菌水沖洗3～4次，于無菌研缽中研磨成漿液。研磨液以無菌水稀釋10倍后，取0.1mL于初篩培養(yǎng)基上常規(guī)涂布，28℃培養(yǎng)72～120h，挑選不同形態(tài)菌落于PDA平板劃線純化后，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)化白藜蘆醇苷HPLC檢測

將初篩菌種接入復(fù)篩培養(yǎng)基(10g/100mL虎杖煮提液)中進行發(fā)酵，28℃、180r/min培養(yǎng)96h，發(fā)酵液10000r/min離心10min后，取上清液100μL甲醇稀釋至1mL，混勻，0.45μm微膜過濾后，即為供試品溶液，HPLC檢測發(fā)酵液中白藜蘆醇苷和白藜蘆醇含量，按下式計算白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化率，篩選轉(zhuǎn)化力最強菌株進行鑒定。

1.5.1 色譜條件

色譜柱ODS-C18柱(150mm×4.6mm，5μm)，流動相為甲醇-水(體積比40:60)，流速0.6mL/min，檢測波長306nm，柱溫25℃，進樣量10μL。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別稱取白藜蘆醇苷和白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品各5mg，甲醇溶解定容至25mL，配制成0.2mg/mL白藜蘆醇苷、白藜蘆醇儲備液，備用。分別取儲備液0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL，用甲醇稀釋至10mL，配制成不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。按色譜條件進樣，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.3 方法學(xué)考察

重復(fù)性考察：稱取發(fā)酵液分別制備5份供試品溶液，測定峰面積，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)；精密度考察：稱取質(zhì)量濃度為40μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液液，重復(fù)進樣5次，測定峰面積，計算RSD；穩(wěn)定性考察：稱取同一供試品溶液于0、2、4、6、8、1 0、1 2、14、16h內(nèi)進樣測定峰面積，計算RSD；加樣回收率考察：稱取已知白藜蘆醇苷、白藜蘆醇含量發(fā)酵液5份，按其含量30%、60%、90%、120%、150%分別加入白藜蘆醇苷、白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品，按供試品方法制備，測定白藜蘆醇苷、白藜蘆醇峰面積，計算加樣回收率。

1.6 轉(zhuǎn)化力最強菌株鑒定

1.6.1 形態(tài)學(xué)鑒定

采用點植法[15]分別接種于CYA、MEA、G25N、CA、PDA培養(yǎng)基平板中心，25℃培養(yǎng)，觀察記錄各培養(yǎng)基中菌落形態(tài)與生長情況。采用插片培養(yǎng)法[15]，經(jīng)乳酸-棉蘭染液染色后，于光學(xué)顯微鏡下觀察記錄菌絲體及孢子形態(tài)特征。

1.6.2 分子生物學(xué)鑒定

1.6.2.1 菌株基因組DNA提取

隨機取2管菌絲體，參照Weiland[16]所述方法提取基因組DNA，等量混合組成菌株基因組DNA樣品，備用。

1.6.2.2 ITS-5.8S rDNA序列PCR擴增

引物ITS 1：5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇，ITS 4：5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇(由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)。PCR反應(yīng)體系(50μL)：10×擴增緩沖液5μL、10μmol/L dNTP 2μL、10μmol/L引物ITS 1 2μL、10μmol/L ITS 4 2μL、1U/μL Taq酶1μL、ddH2O 28μL、模板DNA 4μL。循環(huán)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性40s，55℃復(fù)性35s，72℃延伸40s，以上參數(shù)循環(huán)30次；最后以72℃終延伸10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.6.2.3 PCR產(chǎn)物序列分析

將序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫，通過Blast(www.nebi. nlm.nih.gov/BLAST/)進行同源搜索，尋找與目的序列同源性最高的已知分類地位的菌種。

1.6.2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

從GenBank中索取與內(nèi)生菌株J1同源性高的相似菌株的ITS-5.8S rDNA序列，用MEGA4軟件進行序列分析比對，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 具有轉(zhuǎn)化白藜蘆醇苷能力虎杖內(nèi)生真菌初篩

從新鮮虎杖初篩得到6株內(nèi)生真菌，依次命名為J1、J2、J3、J4、J5、J6，其中J1～J3分離于莖內(nèi)，J4～J6分離于根內(nèi)。

2.2 內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)化白藜蘆醇苷HPLC檢測

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

質(zhì)量濃度為40μg/mL的白藜蘆醇苷、白藜蘆醇標(biāo)樣HPLC色譜圖見圖1、2，白藜蘆醇苷、白藜蘆醇線性回歸方程分別為Y＝133.4412X＋35.6686(r＝0.9996)、Y＝224.1187X＋138.2686(r＝0.9995)，其中，X為質(zhì)量濃度/(μg/mL)，Y為峰面積，兩者均在20～100μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

圖1 白藜蘆醇苷標(biāo)樣HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of standard polydatin sample

圖2 白藜蘆醇標(biāo)樣HPLC圖Fig.2 HPLC chromatogram of standard resveratrol sample

2.2.2 方法學(xué)考察

重復(fù)性：白藜蘆醇苷、白藜蘆醇的RSD值分別為0.92%、0.68%，表明該方法重復(fù)性好；精密度：白藜蘆醇苷、白藜蘆醇的RSD值分別為0.85%、0.75%，表明該方法精密度高；穩(wěn)定性：白藜蘆醇苷、白藜蘆醇的RSD值分別為1.15%、1.21%，表明供試品溶液在16h內(nèi)穩(wěn)定；加樣回收：白藜蘆醇苷、白藜蘆醇的平均加樣回收率分別為95.2%、98.9%，RSD分別為1.03%、1.42%，表明該方法回收率較高，偏差較小，準(zhǔn)確度較高。

2.2.3 白藜蘆醇苷、白藜蘆醇含量檢測

取初篩內(nèi)生真菌J1、J2、J3、J4、J5、J6發(fā)酵液按上述供試品制備方法制備供試品溶液，按上述HPLC色譜條件進樣平行3次。根據(jù)峰面積計算發(fā)酵液中白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化率，結(jié)果見表1，內(nèi)生真菌J1、J2、J3、J4、J5、J6菌株對白藜蘆醇苷的轉(zhuǎn)化率分別為25.6%、3.5%、15.5%、2.1%、5.6%、8.4%，表明6株初篩菌株均對白藜蘆醇苷有不同程度轉(zhuǎn)化能力，其中J1轉(zhuǎn)化率最高。

表1 內(nèi)生真菌J1、J2、J3、J4、J5、J6對白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化能力HPLC檢測結(jié)果Table 1 Transformation rates of polydatin by endophytic fungi J1, J2, J3, J4, J5, J6 as determined by HPLC

圖3 J1發(fā)酵前培養(yǎng)液HPLC圖Fig.3 HPLC chromatogram of hot water extract from Rhizoma Polygoni cuspidati

圖4 內(nèi)生真菌J1發(fā)酵96h后發(fā)酵液HPLC圖Fig.4HPLC chromatogram of hot water extract from Rhizoma Polygoni cuspidati fermented by stain J1 for 96 h

由圖3、4可知，虎杖煮提液經(jīng)內(nèi)生真菌J1發(fā)酵后，白藜蘆醇苷(保留時間5.07min)的吸收峰面積明顯減小，白藜蘆醇(保留時間11.094min)的吸收峰面積明顯增加，說明內(nèi)生真菌J1能有效轉(zhuǎn)化虎杖煮提液中白藜蘆醇苷為目標(biāo)物白藜蘆醇。

2.3 內(nèi)生真菌J1的形態(tài)學(xué)鑒定

內(nèi)生真菌J1在CYA、MEA、G25N、CA、PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d后菌落形態(tài)見表2。

表2 內(nèi)生真菌J1在CYA、MEA、G25N、CA、PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d后菌落形態(tài)特征Table 2 Morphological characteristics of strain J1 colonies after incubation on CYA, MEA, G25N, CA, PDA culture media for 7 days

圖5 內(nèi)生真菌J1在CYA、MEA、G25N、CA、PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.5 Morphological observations of strain J1 on CYA, MEA, G25N, CA, PDA culture media

圖6 內(nèi)生真菌J1菌絲的顯微形態(tài)(×100)Fig.6 Mycelium microstructure of strain J1 (×100)

由圖5～6可知，光學(xué)顯微鏡下觀察J1菌絲細長、交織分布，有隔膜，分生孢子梗光滑，帚狀枝單輪生或雙輪生，小梗 4～6個輪生，分生孢子鏈狀分布，圓形。鑒定表明內(nèi)生真菌J1菌落、菌絲和分生孢子形態(tài)特征與《常用及常見真菌》及《真菌鑒定手冊》青霉屬草酸青霉(Penicillium oχalicum)基本相符，初步鑒定內(nèi)生真菌J1為青霉屬草酸青霉(Penicillium oχalicum)。

2.4 內(nèi)生真菌J1分子生物學(xué)鑒定

2.4.1 內(nèi)生真菌J1基因組DNA提取與ITS-5.8S rDNA擴增

圖7 內(nèi)生真菌J1 DNA電泳圖Fig.7 Electrophoresis of genomic DNA of strain J1

圖8 內(nèi)生真菌J1 ITS-5.8S rDNA PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.8 Electrophoresis of PCR amplified products from ITS-5.8S rDNA of strain J1

提取J1菌株基因組DNA，經(jīng)電泳檢測得到特異性條帶，如圖7所示，表明內(nèi)生真菌J1基因組DNA提取成功。以提取的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，得到約600bp的PCR擴增產(chǎn)物，電泳圖譜見圖8，這與以往ITS-5.8S rDNA在所有真菌中都高度保守且長度恒定(約600bp)的報道相吻合[17]，表明內(nèi)生真菌J1 ITS-5.8S rDNA片段成功擴增。

2.4.2 內(nèi)生真菌J1 ITS-5.8S rDNA序列分析

實驗測得內(nèi)生真菌J1 ITS-5.8S rDNA序列全長571bp，該序列在GenBank數(shù)據(jù)庫登錄號為HQ732137。將序列輸入生物技術(shù)信息網(wǎng)頁(http://www.nebi.nlm.nih. gov/BLAST)進行同源性比對，結(jié)果表明：內(nèi)生真菌J1與草酸青霉Penicillium oχalicum (FJ977097.1)同源性最高，相似性為9 9%。

2.4.3 系統(tǒng)發(fā)育分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

圖9 內(nèi)生真菌J1和相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 9 Phylogenetic tree of strain J1 and other related strains

在GenBank中索取與內(nèi)生真菌J1 ITS-5.8S rDNA序列同源性高的相似菌株13株，用MEGA4軟件進行序列分析，采用N-J法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖9可知，內(nèi)生菌株J1與Penicillium屬的青霉菌處于一個大的分支內(nèi)，與草酸青霉Penicillium oχalicum (FJ977097.1)處于同一分支，進化距離最近。結(jié)合菌落形態(tài)和個體顯微形態(tài)特征結(jié)果，確定內(nèi)生菌株J1為草酸青霉Penicillium oχalicum。

3 討 論

本研究從野生虎杖莖中初篩得到6株內(nèi)生真菌，HPLC法檢測表明：6株內(nèi)生真菌均具有轉(zhuǎn)化白藜蘆醇苷能力，其中J1轉(zhuǎn)化力最強，轉(zhuǎn)化后發(fā)酵液中白藜蘆醇含量達14.0675μg/mL，為未發(fā)酵前的2.65倍。劉蕓等[11]報道不以虎杖為發(fā)酵底物，直接采用內(nèi)生真菌擬輪枝鐮孢霉Fusarium verticillioides生產(chǎn)白藜蘆醇，發(fā)酵液白藜蘆醇含量(1.528μg/mL)遠低于本研究結(jié)果。通過對內(nèi)生真菌J1在上述5種不同培養(yǎng)基上菌落形態(tài)觀察和菌絲、分生孢子等顯微觀察，并結(jié)合對ITS-5.8S rDNA序列與Genbank中的rDNA同源序列的比對分析，鑒定內(nèi)生真菌J1為草酸青霉Penicillium oχalicum，GenBank登錄號為HQ732137。具有特定生活史的植物內(nèi)生真菌與宿主互惠共利協(xié)同進化，選擇內(nèi)生真菌對中草藥進行發(fā)酵轉(zhuǎn)化有其天然協(xié)調(diào)性，但目前，關(guān)于虎杖內(nèi)生真菌的微生物轉(zhuǎn)化未見報道。本研究從新鮮虎杖莖中分離內(nèi)生真菌J1直接作用于虎杖煮提液，不需添加其他成分，有效轉(zhuǎn)化虎杖中白藜蘆醇苷為白藜蘆醇，這與鄧志匯等[9]從茶樹根際分離內(nèi)生毛霉菌轉(zhuǎn)化簡單兒茶素為酯型兒茶素的研究方法相似，充分證明利用植物內(nèi)生真菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化與植物所產(chǎn)相同或相似的生理活性物質(zhì)可行，比直接化學(xué)提取法[18]原材料利用率高，與有機合成法[19]相比，反應(yīng)條件溫和，發(fā)酵條件簡單、易控制，環(huán)境污染小。但分離得到的內(nèi)生真菌J1為野生型菌株，目前轉(zhuǎn)化率最高為25.6%，需要通過誘變育種、發(fā)酵條件優(yōu)化等提高其轉(zhuǎn)化率，為進一步微生物發(fā)酵提高虎杖中白藜蘆醇得率提供技術(shù)支持。

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Isolation and Identification of Endophytic Fungi Capable of Transforming Polydatin from Polygonum cuspidatum

LIU Hua-jin1,2，YI You-jin1,2,*，YANG Jian-kui3，ZHONG Ying-li4，CHEN Xue1,2
(1. College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China ；2. Hunan Province Key Laboratory of Food Science and Biotechnology, Changsha 410128, China ；3. College of Sciences, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China ；4. College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China )

In order to improve the yield of resveratrol from Polygonum cuspidatum through endophytic fungi transformation, endophytic fungal strains capable of transforming polydatin from Polygonum cuspidatum were screened. The contents of resveratrol and polydatin were determined by high performance liquid chromatography (HPLC). The results indicated that 6 endophytic fungal strains capable of transforming polydatin from Polygonum cuspidatum were identified. Strain J1 had the highest transformation rate, 25.6%. The strain J1 was identified as Penicillium oχalicum with Genbank accession number of HQ732137 through morphologic observation and ITS-5.8S rDNA sequence analysis.

Polygonum cuspidatum；polydatin；resveratrol；endophytic fungi；isolation；identification

Q939.9

A

1002-6630(2012)11-0172-05

2011-07-31

湖南省博士后科研資助專項計劃項目(2010RS4003)；長沙市科技局一般項目(K1005013-31)；湖南省中醫(yī)藥科研計劃項目(2010079)

劉華金(1989—)，女，碩士研究生，研究方向為微生物資源開發(fā)與利用。E-mail：lhjdyx117@163.com

*通信作者：易有金(1968—)，女，教授，博士，研究方向為微生物資源開發(fā)與利用及食品營養(yǎng)。E-mail：yiyoujin@163.com