李 勇，王 穎，黃先智，闞建全,*，晉圣坤，賀亞萍，胡益僑，廖 晨

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏重點實驗室，重慶 400715；3.西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400715)

酶解脫脂蠶蛹蛋白制備ACE抑制肽

李 勇1,2，王 穎1,2，黃先智3，闞建全1,2,*，晉圣坤1，賀亞萍1,2，胡益僑1,2，廖 晨1,2

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏重點實驗室，重慶 400715；3.西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400715)

以實驗室自制的脫脂蠶蛹蛋白為原料，利用酶工程技術(shù)，通過對中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶等的篩選及單因素和響應(yīng)面優(yōu)化試驗，對ACE抑制肽的制備工藝條件進行較系統(tǒng)的研究。結(jié)果表明：選擇堿性蛋白酶作為脫脂蠶蛹蛋白制備ACE抑制肽的酶，制備ACE抑制肽的最佳工藝條件為料液比11.88:100、溫度50.22℃、pH 9.46、加酶量7.03%、酶解4h。在此條件下制備的ACE抑制肽的ACE抑制率達到41.98%。

蠶蛹蛋白；ACE抑制肽；酶解；工藝條件

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)在人體血壓形成過程中起重要作用，它催化血管緊張素Ⅰ從C端裂解二肽形成血管緊張素Ⅱ(腎素-血管緊張素系統(tǒng)中已知最強的血管收縮劑)。同時，它能阻抗血管舒張劑——舒緩激肽的降解[1]，抑制ACE的活性，可使血管緊張素Ⅱ的生成和激肽的破壞均減少，從而達到治療高血壓的目的。目前已從許多食源性蛋白質(zhì)中分離得到了ACE抑制肽，如牛乳酪蛋白[2]、沙丁魚[3]、大豆蛋白[4]、花生蛋白[5]、向日葵蛋白[6]等。

蠶蛹(silkworm pupa)含有豐富的蛋白質(zhì)，目前已有報道利用其制備蛋白小肽[7-8]。閔建華等[7]采用堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶水解蠶蛹蛋白，并研究了其產(chǎn)物的抗氧化活性。陳靜等[8]以脫脂蠶蛹蛋白為原料，采用堿性蛋白酶水解蠶蛹蛋白制備緩解體力疲勞的蛋白肽運動飲料。蠶蛹豐富的蛋白質(zhì)中疏水性氨基酸的含量比較高[9]，有研究表明，疏水性氨基酸能提高ACE抑制肽的活性[10-13]。因此，用蠶蛹作為開發(fā)ACE抑制肽的原料是可行的。本實驗以脫脂蠶蛹蛋白作為原料，研究在酶解過程中其ACE抑制率的變化，確定酶解脫脂蠶蛹蛋白制備ACE抑制肽的最佳工藝條件，以期為深入開發(fā)利用蠶蛹蛋白資源及蠶蛹蛋白深加工提供理論依據(jù)，為開發(fā)具有降血壓效果的蠶蛹蛋白ACE抑制肽提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

脫脂蠶蛹蛋白粉，實驗室采用索氏-無水乙醚抽提12h自制。

1.1.2 試劑

ACE、馬尿酰-組胺酰-亮氨酸(HHL) 美國Sigma公司；Neutrase中性蛋白酶、Papain木瓜蛋白酶、A l c a l a s e堿性蛋白酶、P r o t a m e x復(fù)合蛋白酶、Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶 南寧東恒華道生物科技有限公司；Trypsin胰蛋白酶 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；PB-10酸度計 上海雷磁儀器廠；JA2003電子天平 上海精天電子儀器有限公司；DHG-9240電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；ALPAAI-4LSC真空冷凍干燥機 美國Chris公司；Milli-Qbiocel超純水機 美國密理博公司；1-15PK冷凍離心機 美國Sigma公司；LC-20AD 高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 水解度(DH)的測定

在中性和堿性條件下采用pH-stat法[14]計算水解度，計算公式如式(1)所示。

式中：c、V分別為水解過程中所加NaOH的濃度/ (mol/L)和體積/mL；mp為原料中凈蛋白質(zhì)質(zhì)量/g；htot為1g原料蛋白質(zhì)中所含肽鍵的毫摩爾數(shù)，為7.8mmol/g pro；α為氨基的平均解離度，可按α＝10pH-pK/(1＋10pH-pK)計算。其中，pH為水解溶液的pH值；pK為α-氨基的解離度的負對數(shù)，此處取值為7.0。

1.3.2 ACE抑制率的測定[15]

在37℃反應(yīng)體系中依次加入80μL HHL液、降血壓肽液、超純水，每次測試的總體積為0.2mL，把以上混合液放入37℃恒溫水浴中保溫3min，然后加入10μL ACE酶液啟動反應(yīng)，恒溫保持30min后，加入0. 2mL 1mol/L HCl中止反應(yīng)，至室溫，取5μL反應(yīng)產(chǎn)物進樣，通過反相高效液相色譜洗脫圖譜定量馬尿酸的生成量，從而計算降血壓肽的抑制率。對ACE 抑制率為50% 時的降血壓肽濃度為半抑制濃度，即IC50。

式中：A1為不存在降血壓肽時的峰面積；A2為存在降血壓肽與酶時的峰面積。

測定ACE抑制率的色譜條件：檢測器：SPD-M20A；色譜柱：島津 VP-ODS (4.6mm×150mm)；洗脫液：25%乙腈-75% 超純水；洗脫液流速：1mL/min；檢測波長：228nm；進樣量：5μL。

1.3.3 蛋白酶的選擇

分別選用6種蛋白酶水解脫脂蠶蛹蛋白，反應(yīng)在恒溫水浴鍋中進行。料液比1:20，加酶量2%，水解條件分別為：1)Neutrase中性蛋白酶：pH7.0、50℃；2) Papain木瓜蛋白酶：pH6.5、65℃；3)Alcalase堿性蛋白酶：pH8.0、50℃；4)Protamex復(fù)合蛋白酶：pH6.5、50℃；5)Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶：pH7.5、50℃；6) Trypsin胰蛋白酶：pH 7.5、50℃；酶解6h，計算水解度。取樣，立即置于沸水浴中加熱10min滅酶，流水冷卻，水解物在5℃。8000r/min離心10min，收集上清液，用于ACE抑制活性的測定。

1.3.4 Alcalase堿性蛋白酶水解的單因素試驗

料液比為1:20、加酶量為2%、溫度50℃、pH8.0、酶解6h，并每隔1h取樣品，分別測其ACE抑制率。

1.3.4.2 pH值對酶解效果的影響

料液比1:20、加酶量2%、溫度50℃、酶解4h，調(diào)節(jié)pH值分別為8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，分別測酶解液的ACE抑制率。

1.3.4.3 料液比對酶解效果的影響

加酶量2%、pH9.0、酶解4h、溫度50℃，料液比分別為3:50、9:100、3:25、3:20、9:50，分別測酶解液的ACE抑制率。

1.3.4.4 酶解溫度對酶解效果的影響

料液比1:20、加酶量2%、pH9.0、酶解4h，酶解溫度分別為45、50、55、60、65℃，分別測酶解液的ACE抑制率。

2.3.2 固定效應(yīng)與隨機效應(yīng)的判定 需要通過Hausman檢驗(原假設(shè)為“隨機影響模型中個體影響與解釋變量不相關(guān)”)，進一步確定是選取固定效應(yīng)模型還是隨機效應(yīng)模型．

1.3.4.5 加酶量對酶解效果的影響

料液比1:20、pH9.0、溫度50℃、酶解4h，加酶量分別為3%、5%、7%、9%、11%，分別測酶解液的ACE抑制率。

1.3.5 Alcalase堿性蛋白酶的水解條件優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，采用響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計，運用Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計原理，選擇對ACE抑制率有影響的4個因素：料液比、加酶量、pH值、溫度，進行四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(表1)，以ACE抑制率作為響應(yīng)變量。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗因素與水平Table 1 Coded values and corresponding actual values of the hydrolysis conditions tested in response surface analysis

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

實驗數(shù)據(jù)均是經(jīng)過3次平行實驗得到的平均值，并計算其誤差，使用Design Expert分析響應(yīng)面數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解的單因素試驗結(jié)果

2.1.1 不同蛋白酶對ACE抑制率及其水解度的影響

圖1 6種酶解液的ACE抑制率及其水解度的比較Fig.1 ACE-inhibitory rates and hydrolysis degrees of pupa protein hydrolysates from 6 kinds of proteases

由圖1可知，在酶解6h時，使用堿性蛋白酶的脫脂蠶蛹蛋白酶解液的ACE抑制率最高，達到了32.46%，這說明酶解得到的多肽具有抑制ACE酶活的作用。而使用胰蛋白酶的酶解液的水解度最高，達到25.66%，其酶解的程度較其他酶高，但其ACE抑制率只有4.87%，這說明其酶解生成的多肽大多不具有抑制ACE酶活性的作用。由此可看出ACE抑制率與水解度并沒有相關(guān)性，這與前人的研究一致。因此，之后的研究就只以ACE抑制率為指標，篩選用堿性蛋白酶生產(chǎn)ACE抑制肽的工藝條件。

2.1.2 酶解時間對酶解液ACE抑制率的影響

由圖2可知，在前3h內(nèi)，ACE抑制率增加的趨勢很快，到了3h后就比較平緩。4h時，ACE抑制率為32.09%，6h為32.46%，增加不明顯?？紤]生產(chǎn)成本，選擇酶解4h作為后期實驗的酶解時間。

圖2 酶解時間對酶解液ACE抑制率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on ACE-inhibitory rate of pupa protein hydrolysate

2.1.3 pH值對酶解液ACE抑制率的影響

pH值是酶反應(yīng)的主要條件之一，最適pH值是酶促反應(yīng)的重要參數(shù)。過酸過堿都會使酶的空間構(gòu)象發(fā)生改變，使酶活降低，而且p H值可改變底物空間解離狀態(tài)，影響與酶的結(jié)合。pH值對酶解液ACE抑制率的影響見圖3。在pH9.5時，其ACE抑制率達到最高，為35.42%。隨著pH值的繼續(xù)增加，其ACE抑制率逐漸降低。因此，選取9.5作為其較佳的酶解pH值。

圖3 pH值對酶解液ACE抑制率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis pH on ACE-inhibitory rate of pupa protein hydrolysate

2.1.4 料液比對酶解液ACE抑制率的影響

圖4 料液比對酶解液ACE抑制率的影響Fig.4 Effect of material/liquid ratio on ACE-inhibitory rate of pupa protein hydrolysate

由圖4可知，隨著料液比的增加，其ACE抑制率也逐漸增加，當料液比為3:25時，其ACE抑制率最高，為39.20%，之后又緩慢下降。因此，選取3:25作為其較佳的料液比。

2.1.5 酶解溫度對酶解液ACE抑制率的影響

圖5 酶解溫度對酶解液ACE抑制率的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on ACE-inhibitory rate of pupa protein hydrolysate

由圖5可知，酶解溫度對酶解液的ACE抑制率的影響呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當50℃時為最大值36.00%。因此，取酶解溫度為50℃。

2.1.6 加酶量對酶解液ACE抑制率的影響

圖6 加酶量對酶解液ACE抑制率的影響Fig.6 Effect of enzyme concentration on ACE-inhibitory rate of pupa protein hydrolysate

由圖6可知，加酶量為5%～7%時，其酶解液的ACE抑制率逐漸變大，在7%時達到峰值35.92%，之后隨著加酶量的繼續(xù)增加，其抑制率卻變小。因此，選取加酶量為7%。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

采用Box-Behnken設(shè)計，利用Design Expert 7.0軟件對試驗結(jié)果進行響應(yīng)面分析(表2)，得出回歸模型參數(shù)的方差分析，見表3。

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 二次響應(yīng)模型方差分析Table 3 ANOVA results obtained for the established regression model

由表3方差分析可知，模型的P值顯著。失擬項P＝0.3276(＞0.05)，差異不顯著，未知因素對試驗結(jié)果干擾小，說明殘差均由隨機誤差引起。R2＝0.9907，說明模型擬合程度良好，試驗誤差小，該模型能夠反映響應(yīng)值的變化。其二次方程為：

對表2的結(jié)果作響應(yīng)面及其等高視線圖，如圖8～12所示，可以看出，任意兩個因素間均存在比較明顯的交互作用，最佳落點在試驗考察的區(qū)域內(nèi)。

圖7 料液比和酶解溫度相互作用對ACE抑制率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.7 Response surface and contour plots for the effect of material/ liquid ratio and hydrolysis temperature on ACE-inhibitory rate of pupa protein hydrolysate

圖8 料液比和pH值相互作用對ACE抑制率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.8 Response surface and contour plots for the effect of material/ liquid ratio and enzymatic hydrolysis pH on ACE-inhibitory rate of pupa protein hydrolysate

圖9 料液比和加酶量相互作用對ACE抑制率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.9 Response surface and contour plots for the effect of material/ liquid ratio and enzyme addition amount on ACE-inhibitory rate of pupa protein hydrolysate

圖10 酶解溫度和pH值相互作用對ACE抑制率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.10 Response surface and contour plots for the effect of hydrolysis temperature and enzymatic hydrolysis pH on ACE-inhibitory rate of pupa protein hydrolysate

圖11 酶解溫度和加酶量相互作用對ACE抑制率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.11 Response surface and contour plots for the effects of hydrolysis temperature and enzyme addition amount on ACE-inhibitory rate of pupa protein hydrolysate

圖12 pH值和加酶量相互作用對ACE抑制率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.12 Response surface and contour plots for the effects of hydrolysis pH and enzyme addition amount on ACE-inhibitory rate of pupa protein hydrolysate

2.2.2 驗證實驗

利用Design Expert 7.0軟件進行工藝參數(shù)的優(yōu)化組合[16]，對優(yōu)化工藝參數(shù)進行驗證，在料液比11.88:100、酶解溫度50.22℃、pH9.46、加酶量7.0 3%的條件下，所得ACE抑制膠A C E抑制率的預(yù)測值為42.09%，實際值為(41.98±0.06)%。

圖13 HPLC測定脫脂蠶蛹多肽的ACE抑制活性色譜圖Fig.13 HPLC chromatograms of pupa polypeptide with ACE inhibitory activity

脫脂蠶蛹多肽的ACE抑制活性HPLC色譜圖如圖13所示，與預(yù)測值基本一致，從而驗證了回歸方程的正確性，證明了實驗設(shè)計與分析方法較為準確可靠。

3 結(jié) 論

比較了6種商業(yè)化蛋白酶水解脫脂蠶蛹蛋白所得水解產(chǎn)物的ACE抑制活性，結(jié)果表明：堿性蛋白酶為最適生產(chǎn)脫脂蠶蛹蛋白ACE抑制肽的生產(chǎn)用酶。對酶解條件進行優(yōu)化，在料液比11.88:100、溫度50.22℃、pH9.46、加酶量7.03%、水解4h時，脫脂蠶蛹蛋白酶解產(chǎn)物有最大ACE抑制活性，為41.98%。

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Enzymatic Preparation of ACE-Inhibitory Peptide from Pupa Protein

LI Yong1,2，WANG Ying1,2，HUANG Xian-zhi3，KAN Jian-quan1,2,*，JIN Sheng-kun1，HE Ya-ping1,2， HU Yi-qiao1,2，LIAO Chen1,2
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；2. Chongqing Key Laboratory of Produce Processing and Storage, Chongqing 400715, China；3. College of Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Defatted pupa protein was prepared in our laboratory and used further to prepare ACE-inhibitory peptide by enzymatic hydrolysis. The best protease for preparing ACE-inhibitory peptide from pupa protein was chosen out of neutral protease, alcalase, papain, protamex, flavourzyme and trypsin. The hydrolysis process was optimized using response surface methodology. Neutral protease was found to be the best among all investigated proteases. The optimal hydrolysis conditions were determined as follows: substrate concentration of 11.88:100, hydrolysis temperature of 50.22 ℃, hydrolysis pH of 9.46, and enzyme concentration of 7.03%, hydrolysis time of 4 h. Under these conditions, pupa protein hydrolysate with an ACE-inhibitory rate of 41.98% was obtained.

pupa protein；ACE-inhibitory peptide；enzymatic hydrolysis；process conditions

TS218

A

1002-6630(2012)11-0151-07

2011-06-06

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(桑蠶)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-22-ZJ0503)

李勇(1986—)，男，碩士研究生，研究方向為食品化學(xué)與營養(yǎng)學(xué)。E-mail：frog46@126.com

*通信作者：闞建全(1965—)，男，教授，博士，研究方向為食品化學(xué)與營養(yǎng)學(xué)、食品生物技術(shù)。E-mail：ganjq1965@163.com