高 博，馬 玲，張 念，3，毛 燕，陳鳳蓮，張守峰，劉 燁，張 菲，扈榮良，吳健敏＊

（1.廣西獸醫(yī)研究所廣西畜禽疫苗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林長(zhǎng)春 130122；3.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130062）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的懷孕豬流產(chǎn)及仔豬呼吸道癥狀為主要特征，并造成世界養(yǎng)豬業(yè)巨大經(jīng)濟(jì)損失的一種免疫抑制性疾?。?－2］。PRRSV屬于動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎病毒屬成員［3］。基因組為單股正鏈RNA病毒，包含8個(gè)～9個(gè)開(kāi)放閱讀框，其中ORF1a和ORF1b編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，ORF2～ORF7編碼結(jié)構(gòu)蛋白，GP2～GP5為糖基化蛋白，N蛋白為核蛋白，M 蛋白為基質(zhì)蛋白［4－6］。由ORF5編碼的GP5蛋白可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，是最主要的保護(hù)性抗原；由ORF6編碼的M蛋白是PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白中最保守的蛋白，具有很強(qiáng)的免疫原性，與細(xì)胞免疫有關(guān)［7］，且研究表明 M蛋白可以對(duì)GP5蛋白產(chǎn)生協(xié)同作用，使其產(chǎn)生的抗體水平更高?；诖?，本研究將GP5和M基因作為構(gòu)建重組活載體疫苗的候選基因。

1953年，Rowe W P等［8］在用扁桃體組織塊培養(yǎng)物分離“感冒病毒”過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了一種未知病毒。第2年，Hilleman M R等［9］從急性呼吸道患者分離出類似的病毒。1956年，Enders J F等［10］根據(jù)病毒經(jīng)常存在于腺體，且第1次就是從腺體組織中分離獲得的事實(shí)，建議將這類病毒稱為“腺病毒”。此后，相繼由人、猴、豬、馬、牛、羊、犬、小鼠和雞等分離出100多個(gè)血清型的腺病毒［11］。腺病毒可感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞種類多，如肺細(xì)胞、肝細(xì)胞、骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、腦細(xì)胞等。其感染細(xì)胞滴度和外源基因的表達(dá)水平較高，因此腺病毒同皰疹病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、痘病毒一樣是目前最為廣泛使用的病毒載體。以腺病毒為載體構(gòu)建重組疫苗，表達(dá)主要抗原及以腺病毒為載體進(jìn)行癌癥、遺傳病和重要傳染病的基因治療等，是當(dāng)前科研工作者研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。本研究是以腺病毒為載體，以GP5和M基因?yàn)榘谢驑?gòu)建PRRS重組腺病毒，以期為PRRS重組腺病毒疫苗的研制提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、質(zhì)粒、細(xì)胞、菌種 PRRSV、pIRESneo質(zhì)粒、DH5α菌種均由本實(shí)驗(yàn)室保存；pMD18－T購(gòu)自TaKaRa公司；293AD細(xì)胞（人胚腎細(xì)胞）、pac－Ad5CMVK－NpA 穿梭載體、pacAd5 9.2－100骨架載體購(gòu)于CELL BIOLABS公司。

1.1.2 試劑 AMV Reverse Transcriptase、RNase Inhibitor、dNTP、Ex－TaqDNA 聚 合 酶、CAIP、T4DNA連接酶以及限制性內(nèi)切酶EcoR V、EcoR I、SmaI、XhoI、MluI、BST1107I購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；Klenow購(gòu)自Biolabs公司；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自Axygen公司；轉(zhuǎn)染試劑FuGENE?HD Transfection Reagent購(gòu)自Roche公司；熒光素FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG、辣根標(biāo)記羊抗鼠IgG購(gòu)自GeneTex公司；伊文思藍(lán)購(gòu)自Sigma公司產(chǎn)品；甲醇、吐溫－80購(gòu)自北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 參考GenBank登錄號(hào)AF032626關(guān)于Ch－1a株的全基因序列，利用primer5.0設(shè)計(jì)并合成針對(duì)PRRSV基因GP5和M基因全長(zhǎng)的特異引物（劃線部分為引入的EcoR V、BamH I和EcoR V、SpeI），由南京金斯瑞生物科技有限公司合成（表1）。

表1 PCR引物序列Table 1Primer sequences of PCR

1.2.2 載體的構(gòu)建 以PRRSV細(xì)胞毒為模板，PCR擴(kuò)增出GP5和M基因，將GP5定向克隆至真核表達(dá)載體pIRES－neor的多克隆位點(diǎn)EcoR V和EcoR I之間的同時(shí)用M基因替代壓力篩選基因neor，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pIRES－GP5－M；將包含有GP5和 M基因的表達(dá)盒定向克隆至穿梭質(zhì)粒pacAd5CMVKNpA多克隆位點(diǎn)EcoR V處，獲得重組穿梭質(zhì)粒pac－Ad5CMVK－NpA－GP5－M。

1.2.3 重組腺病毒的獲得 線性化的重組穿梭質(zhì)粒pacAd5CMVK－NpA－GP5－M與pacI消化的骨架質(zhì)粒pacAd5 9.2－100于六孔板中共轉(zhuǎn)染293AD細(xì)胞。7d觀察細(xì)胞病變（Cytopathic effect，CPE），若無(wú)CPE，補(bǔ)加1mL100mL／L小牛血清的DMEM。之后，每天觀察1次，待14d，若還沒(méi)有CPE，繼續(xù)補(bǔ)加1mL的100mL／L小牛血清 的DMEM 培養(yǎng)至21d，若無(wú)CPE，則將其反復(fù)凍融2次，10%接種293AD細(xì)胞，培養(yǎng)3d～4d，若沒(méi)有CPE，則判斷轉(zhuǎn)染失敗。若中間過(guò)程出現(xiàn)CPE，待其病變程度達(dá)到80%，反復(fù)凍融2次，接293AD細(xì)胞，連續(xù)3代若均出現(xiàn)CPE，則認(rèn)為獲得重組病毒。

1.2.4 重組病毒的鑒定

1.2.4.1 重組病毒的PCR擴(kuò)增 取50μL病變的293AD細(xì)胞，煮沸5min之后，12 000g／min離心5min，取上清作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.4.2 間 接 免 疫 熒 光 （indirect immunofluorescence） 在96孔板中鋪加正常的293AD細(xì)胞，待其長(zhǎng) 成 80%，每 孔 加 入 重 組 腺 病 毒 rAdv－GP5－M 100μL，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2溫箱培養(yǎng)24h，使重組腺病毒充分感染293AD細(xì)胞。用丙酮與甲醛1∶1固定10min后；以PRRSV高免血清為一抗，孵育2h，PBS洗滌3次；以熒光標(biāo)記的羊抗鼠的IgG為二抗，37℃作用30min，PBS洗滌3次，吹干，加入緩沖甘油，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 Western blot分析 將接種重組腺病毒rAdv－GP5－M的293AD細(xì)胞培養(yǎng)24h，用細(xì)胞裂解液裂解后，離心取上清進(jìn)行SDS－PAGE。之后轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，用脫脂牛奶封閉后，加入高免血清，37℃孵育1h，PBS洗滌3次之后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37℃作用40min，洗滌后加入顯色液顯色，觀察。

1.2.6 重組病毒的純化及電鏡觀察 將收獲的病毒液上清，在4℃ 以12 000r／min離心10min，去除細(xì)胞碎片。將上清加到Beckman離心管中，每管加入10mL，25 000r／min離心2h，將收獲的病毒液凍于－70℃保存。取純化的病毒10μL，電鏡觀察病毒形態(tài)。

1.2.7 重組病毒的TCID50測(cè)定 在6孔板中，每孔鋪上2mL的293AD細(xì)胞混合液，約含有2×105細(xì)胞／mL，使細(xì)胞均勻分散，放入37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2溫箱培養(yǎng)24h。將病毒200μL接種于293AD細(xì)胞中，繼續(xù)在溫箱培養(yǎng)3d～5d，每天觀察細(xì)胞病變。參照文獻(xiàn)［8］中的Karber法計(jì)算TCID50。

1.2.8 重組病毒的遺傳穩(wěn)定性 重組病毒連續(xù)多次傳代，測(cè)定其遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

以PRRSV細(xì)胞毒為模板，PCR擴(kuò)增出GP5和M片段，獲得大小603bp和525bp的片段，結(jié)果如圖1和圖2。

圖1 GP5基因的PCR擴(kuò)增Fig.1PCR identification of GP5gene

圖2 M基因的PCR擴(kuò)增Fig.2PCR identification of M gene

2.2 重組真核表達(dá)載體pIRES－GP5－M的酶切鑒定

將測(cè)序正確之后的GP5和M基因定向克隆至pIRESneo質(zhì)粒之后，以MluI和Bst1107I雙酶切pIRES－GP5－M，獲得大小3 062bp和2 566bp的片段（圖3）。

圖3 pIRES－GP5－M 的酶切鑒定Fig.3Identification of the pIRES－GP5－M by enzyme digestion

2.3 重組穿梭載體 pacAd5CMVK－NpA－GP5－M的鑒定

將含有GP5和M基因的表達(dá)盒，定向克隆至穿梭載體pacAd5CMVK－NpA，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pacAd5CMVK－NpA－GP5－M，以PacI對(duì) pacAd5 CMVK－NpA－GP5－M 進(jìn)行了鑒定，用250bp DNA Marker和用DNA Marker DL 15 000分別進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖4。

圖4 pacAd5CMVK－NpA－GP5－M的鑒定Fig.4Identification of pacAd5CMVK－NpA－GP5－M

2.4 重組病毒的獲得

轉(zhuǎn)染后14d細(xì)胞局部出現(xiàn)變圓、聚集、隨后會(huì)大量脫落，如圖5。

圖5 重組病毒的拯救Fig.5Rescue of the recombinant virus

2.5 重組病毒的PCR擴(kuò)增

將病變細(xì)胞凍融物煮沸5min作為模板，擴(kuò)增GP5和M基因，獲得大小603bp和525bp的片段，結(jié)果如圖6。

1，2.PCR產(chǎn)物（GP5）；M.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；3.陰性對(duì)照；4.PCR產(chǎn)物1，2.PCR products（GP5）；M.DNA Marker DL 2 000；3.Negative control；4.PCR products

2.6 間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果

以PRRSV陽(yáng)性血清為一抗，以熒光標(biāo)記的羊抗鼠的IgG為二抗，進(jìn)行間接免疫熒光組化，結(jié)果顯示重組病毒感染的細(xì)胞出現(xiàn)熒光，而對(duì)照組沒(méi)有熒光，如圖7。

2.7 Western blot分析

將重組腺病毒接種于293AD細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)24h，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，以PRRS高免血清為一抗，以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，進(jìn)行Western blot分析。獲得大小18ku和25ku的目的條帶，結(jié)果如圖8。

2.8 TCID50的測(cè)定

接種后96h，觀察細(xì)胞病變，并計(jì)算TCID50，該重組病毒的 TCID50為10－6.5／mL。

2.9 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

連續(xù)傳代試驗(yàn)證實(shí)，重組腺病毒在細(xì)胞內(nèi)繁殖，可以有效地轉(zhuǎn)錄并表達(dá)GP5和M蛋白，具有較高的遺傳穩(wěn)定性。

圖7 間接免疫熒光分析Fig.7Indirect immunofluorescence test

圖8 重組病毒rAd5v－GP5－M Western blot分析Fig.8Western blot analysis of rAd5v－GP5－M

3 討論

PRRSV是引起PRRS的病原，基因組包含6個(gè)～7個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，其中GP5蛋白可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，是其最主要的抗原蛋白。M蛋白的免疫原性非常好，感染后10d就可以檢測(cè)到免疫應(yīng)答，且該蛋白可以提高細(xì)胞免疫，協(xié)同作用而使GP5產(chǎn)生的抗體水平提高［12］。因而本研究以GP5和M基因?yàn)榘谢颍瑯?gòu)建了一株重組腺病毒，并對(duì)該腺病毒進(jìn)行了一系列的鑒定和分析，為新型PRRSV活載體疫苗的研制提供了基礎(chǔ)。

PRRS被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，每年對(duì)世界養(yǎng)豬業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失難以估量。而目前對(duì)該病的防制主要是疫苗接種（傳統(tǒng)疫苗）。但傳統(tǒng)疫苗如滅活苗存在免疫失、免疫次數(shù)多、免疫劑量大及抗體產(chǎn)生期比較長(zhǎng)等缺點(diǎn)；雖然弱毒苗抗體產(chǎn)生速度快，但使用弱毒苗而導(dǎo)致豬發(fā)病的例子屢見(jiàn)不鮮。且血清學(xué)不能區(qū)分疫苗免疫和野毒感染，為國(guó)際貿(mào)易帶來(lái)了不便，因而新型疫苗的研制就成為熱點(diǎn)。其中活載體疫苗因其免疫動(dòng)物向宿主免疫系統(tǒng)提交免疫原性蛋白的方式與自然感染時(shí)的真實(shí)情況很接近，可誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，甚至黏膜免疫等優(yōu)點(diǎn)，為眾多研究者所青睞。而腺病毒是其中背景最為清楚，研究最為透徹的活病毒載體之一，在眾多腺病毒載體中，又以Ad2和Ad5研究最多，也應(yīng)用最為廣泛。本研究所使用的腺病毒表達(dá)系統(tǒng)是由CELL BIOLABS公司研發(fā)的人5型腺病毒表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)在以前腺病毒的基礎(chǔ)上進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化，缺失了E1區(qū)和左側(cè)的ITR，由輔助細(xì)胞系和骨架質(zhì)粒提供，使之成為復(fù)制缺陷型病毒，進(jìn)一步降低了復(fù)制性病毒的出現(xiàn)；細(xì)胞內(nèi)同源重組避免了經(jīng)典同源重組方法中的蝕斑篩選及pAdEasy Expression System細(xì)菌內(nèi)同源重組子篩選所耗費(fèi)的大量人力和物力，可以在短短21d內(nèi)獲得重組病毒，重組病毒具有很好的遺傳穩(wěn)定性，且外源基因的表達(dá)量更高。

本研究將PRRSV GP5和M基因?yàn)榘谢?，?gòu)建了1株含有GP5和M基因的重組腺病毒，并在293AD細(xì)胞上得到了表達(dá)，滴度測(cè)定和連續(xù)傳代試驗(yàn)結(jié)果表明該重組腺病毒的滴度可以達(dá)到10－6.5TCID50，且具有良好的遺傳穩(wěn)定性，為PRRSV重組腺病毒疫苗的研制打下了基礎(chǔ)。

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