楊依霏，羅青平，張蓉蓉，艾地云，廖永洪，邵華斌＊，程國富＊

（1.華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院動物病理實驗室，湖北武漢430070；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，湖北武漢430064）

鴨疫里氏桿菌（Riemerellaanatipestifer，RA）是一種隸屬于黃桿菌科，無運動性、不形成芽胞的革蘭陰性菌。該菌可引起鴨、火雞以及其他水禽的疾病，即鴨疫里氏桿菌病或傳染性漿膜炎［1］，可以引起雛鴨的大量死亡，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。RA的血清型復雜，目前公認的有21種［2］，給本病的免疫預防和診斷帶來極大困難。雖然國內外已經(jīng)先后報道了檢測RA血清抗體的玻板凝集試驗、瓊脂擴散試驗以及間接免疫熒光抗體檢測等方法。但也存在靈敏度低、操作步驟繁瑣、檢測設備昂貴等缺點。ELISA方法具有靈敏度高、特異性強、操作簡便等優(yōu)點，是目前應用廣泛的檢測方法之一。外膜蛋白（omp）是革蘭陰性菌特有的一種結構蛋白，具有良好的免疫原性，是亞單位疫苗的候選組成部分，成為目前的研究熱點。本研究中選取RA的外膜蛋白ompA基因進行克隆和原核表達，建立以重組ompA蛋白為包被抗原，檢測RA血清抗體的間接ELISA方法。

1 材料與方法

1.1 材料

原核表達載體pET－28a（＋），感受態(tài)細胞E.coliBL21－DE3，1型鴨疫里氏桿菌菌株由湖北省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)所保存。TransTaq－T、dNTPs、DNA標準DL 2 000、DNA標準DL15 000購自北京全式金公司；限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ，T4連接酶購自寶生物工程（大連）有限公司；低分子質量標準蛋白Marker購自于Fermentas公司；凝膠回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒購自于北京索萊寶科技有限公司；細菌基因組提取試劑盒購自于北京天根生物科技公司；鎳親和層析柱填料購自于GE Healthcare；HRP標記的兔抗鴨IgY購自于美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 ompA蛋白的表達純化及活性檢測

1.2.1.1 引物設計 根據(jù)GenBank公布（登錄號：FJ765052）GD081108株ompA 全 序 列，應 用primer 5軟件設計特異性引物，分別在上游與下游插入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。上游引物F：5′－CCATGGATCCATGGACAAGGAGTTTATG－3′，下 游 引 物 R： 5′ －CGCCTCGAGTTATTTTCTTTTCTTTTTTAC－3′

1.2.1.2 DNA的提取 挑取RA單菌落于TSB（含100mL／L新生牛血清）培養(yǎng)基中，搖振過夜培養(yǎng)。取新鮮菌液用細菌基因組提取試劑盒提取DNA。

1.2.1.3 PCR擴增及鑒定 在PCR反應管中加入10μL 10×PCR buffer，上下游引物各 4μL，2.5mmol／L dNTPs 4 μL，TransTaq－T 2μL，DNA模板4μL，加滅菌ddH2O補足至100μL。PCR反應條件：95℃7min；95℃50s；55℃50s；72℃90s，30個循環(huán)；72℃7min。經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產(chǎn)物，凝膠回收試劑盒回收。

1.2.1.4 原核表達載體的構建和表達 將ompA基因片段經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后定向克隆到原核表達載體pET－28a（＋），轉化感受態(tài)細胞E.coliBL21－DE3，挑取單菌落擴大培養(yǎng)后提取質粒DNA。經(jīng)雙酶切鑒定，選出重組質粒轉化陽性菌，送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。將測序正確的陽性克隆接種于LB液體培養(yǎng)基（含50μg／mL卡那霉素）中，以終濃度為1mmol／L的IPTG誘導表達5h，收集菌體。超聲波破碎菌體，分別取破碎后沉淀和上清，經(jīng)120g／L SDS－PAGE電泳檢測表達蛋白。

1.2.1.5 表達蛋白的純化 按照《分子克隆實驗指南》［3］中的蛋白質純化一節(jié)操作。誘導表達的蛋白用8mol／L尿素裂解過夜，離心取上清。經(jīng) His－Bind樹脂進行純化，取2mL鎳親和層析填料裝入層析柱中，先后分別用200mL／L乙醇、ddH2O各20mL清洗填料；加入平衡緩沖液20mL平衡柱子；上樣，速度在0.5mL／min以內；加入平衡緩沖液20mL洗掉雜蛋白；用含有250mmol／L咪唑的洗脫緩沖液20mL洗下蛋白；ddH2O 清洗填料；取200mL／L乙醇保護填料。

1.2.1.6 免疫轉印表達產(chǎn)物 經(jīng)SDS－PAGE電泳后以恒溫電流80mA，45min電轉移至硝酸纖維膜（NC膜）上，將薄膜放入含有30g／L BSA的PBST（0.01mol／L，pH 7.4）中室溫水平搖床封閉1h～2h，0.01mol／L PBST洗滌3次，于1∶200稀釋的1型 RA陽性血清中（0.01mol／L PBST稀釋）4℃作用過夜，洗滌3次，再加1∶5 000稀釋的HRP標記的兔抗鴨IgY，37℃作用1h，洗滌3次，加DAB＋H2O2顯色，顯色結束后用ddH2O終止反應。

1.2.2 間接ELISA檢測方法的建立

1.2.2.1 RA陰性和陽性血清的制備 按常規(guī)方法制備陽性血清和陰性血清。選7d健康麻鴨10羽，用1型鴨疫里氏桿菌滅活油乳劑疫苗頸部皮下注射，3次免疫，每次免疫間隔14d。收集血清備用。同時收集未免疫的雛鴨血清作為陰性血清備用。

1.2.2.2 間接ELISA方法的操作 ①將純化的ompA重組蛋白用包被液稀釋后每孔加100μL，4℃包被過夜，用洗滌液洗滌3次，每次3min；②以含10g／L BSA的PBST于37℃封閉1h，同上洗滌；③每孔加入待檢血清100μL，37℃孵育1h，同上洗滌；④每孔加入建議工作濃度的HRP標記的兔抗鴨IgY 100μL，37℃孵育1h，同上洗滌；⑤每孔加入100μL的反應底物液，37℃避光反應10min；⑥加入100μL終止液，然后在酶標儀上讀取OD450nm值。每板設立陰陽性對照孔。

1.2.2.3 陰陽性臨界值確定 取30份陰性血清100倍稀釋后作為待檢血清，測OD450nm值后求平均值和標準差，以ˉx＋3SD為此間接ELISA方法的陰性臨界值。

1.2.2.4 ELISA 的特異性試驗

1.2.2.4.1 交叉試驗 在相同條件下，按1.2.2.2操作步驟。以鴨源大腸埃希菌、鴨源多殺巴氏桿菌、鴨源鏈球菌、鴨源呼腸病毒、1型鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒的陽性血清為被檢血清，測OD450nm值。

1.2.2.4.2 阻斷試驗 陽性血清與陰性血清中按1∶10（v／v）的比例加入RA抗原，混勻后37℃作用1h，10 000r／min離心20min。用此處理過的陰、陽性血清1∶100稀釋后，與未加抗原處理的陰、陽性血清同時作間接ELISA測定。比較阻斷前后血清的OD450nm值變化。

1.2.2.5 ELISA的重復性試驗 取同一批包被的重組蛋白ompA酶標條，在其他條件不變的情況下對4份鴨血清用已建立的間接ELISA方法進行檢測，每份樣品重復檢測4孔，測得OD450nm值，計算其變異系數(shù)（CV）。用同樣4份血清在3塊不同批包被的酶標條上試驗，測得OD450nm值，計算其變異系數(shù)（CV）。

1.2.2.6 間接ELISA檢測方法與微量凝集試驗敏感性比較 取RA陽性血清4份分別進行間接ELISA檢測與微量凝集試驗，測定血清效價。

1.2.2.7 標準曲線與回歸方程的建立 應用直線回歸分析，1∶100稀釋的鴨血清OD450nm值與ELISA效價具一定的有線性關系。操作方法如下：取20份不同滴度的RA陽性血清，1∶100稀釋后，再倍比稀釋7個滴度作間接ELISA。每份血清的ELISA效價定為OD450nm值大于陰陽性血清臨界值的血清最高稀釋濃度。最后以每份血清最佳稀釋倍數(shù)稀釋時的OD450nm值為橫坐標，以相應血清ELISA效價（ET）倒數(shù)的自然對數(shù)為縱坐標作回歸曲線。

1.2.3 RA滅活油乳劑疫苗免疫雛鴨后抗體消長規(guī)律 于湖北省某鴨場購1日齡麻鴨40羽，隨機分成2組（20羽／組）。試驗組于7d、14d免疫1型RA滅活油乳劑疫苗，頸部皮下注射0.5mL／羽；對照組同時皮下注射等量生理鹽水。分別在免疫后定期采血測定對照組、免疫組ELISA效價，做出抗體消長曲線。

2 結果

2.1 pET－28a（＋）－ompA 質粒的構建及重組ompA蛋白的表達與純化

2.1.1 ompA基因的PCR擴增及測序 經(jīng)PCR擴增后，電泳檢測，結果與預期大小相符，為1 200bp左右的目的條帶（圖1）。測序結果顯示，目的片段長度為1 164bp。將目的基因序列在Gen－Bank經(jīng)Blast分析，與不同地區(qū)鴨疫里氏桿菌ompA的序列進行比對（登錄號：FJ65052、FJ65042、HO701135、EF117758等），其同源性為96%～100%。

2.1.2 pET－28a（＋）－opmA 基因的克隆及鑒定將ompA基因片段定向插入到原核表達載體pET－28a（＋）中，隨機挑取單菌落提取質粒，并用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切驗證，電泳可見約5.3kb和1 164bp條帶（圖2）。

2.1.3 ompA重組蛋白的表達及純化 將pET－28a（＋）－ompA 重組質粒轉化到E.coliBL21－DE3中挑取陽性菌，擴大培養(yǎng)后加入終濃度1mmol／L的IPTG誘導5h后，菌液經(jīng)低溫超聲破碎后，表達產(chǎn)物主要存在于裂解菌液的包涵體中，呈不溶性表達。經(jīng)120g／L SDS－PAGE電泳檢測，目的蛋白約為42ku（圖3）。經(jīng)尿素變性后，His－Band親和純化后進行Western blot分析，與RA陽性血清呈陽性反應（圖4）。

圖3 重組蛋白ompA的SDS－PAGEFig.3 SDS－PAGE of recombinant protein of ompA

圖2 重組質粒pET－28a（＋）－ompA雙酶切鑒定Fig.2Double enzyme digestion identification of the recombinantion plasmid with BamHⅠand XhoⅠ

圖4 重組蛋白ompA的Western blot分析Fig.4Western blot analysis of recombinant ompA

2.2 間接ELISA方法的建立

2.2.1 間接ELISA最佳反應條件的確定 方陣滴定法結果顯示，重組ompA蛋白的間接ELISA的最佳抗原包被濃度為1.5μg／mL，最佳血清稀釋度為1∶100。酶標兔抗鴨IgY的最佳工作濃度為1∶5 000。

2.2.2 間接ELISA陰陽性臨界值的確定 30份陰性血清1∶100稀釋后，經(jīng)間接ELISA檢測的平均值OD450nm為0.099，標準差為0.022，則ˉx＋3SD 為0.166，即為陰性血清的臨界值。

2.2.3 特異性試驗 鴨源其他病原體抗血清1∶100稀釋后與ompA重組蛋白反應，均呈陰性反應，RA陽性血清呈陽性反應（表1）。3份陽性血清阻斷后的OD450nm值明顯低于阻斷前的檢測值，表明重組ompA蛋白抗原特異性吸附被檢血清的特異性抗體（表2）。

2.2.4 重復性試驗 以不同效價的血清稀釋100倍后做平行重復ELISA檢測，結果顯示批內重復的變異系數(shù)小于5%（1.8%～4.6%），批間重復變異系數(shù)小于9%（1.2%～8.8%）。

2.2.5 間接ELISA與微量凝集試驗的敏感性 比較結果表明，建立的間接ELISA檢測方法的敏感性要明顯高于普通的微量凝集試驗。對選取的4份RA陽性血清效價進行測定結果顯示，微量凝集試驗接ELISA結果顯示血清效價分別為1∶1 600、1∶1 600、1∶800、1∶12 800，即間接ELISA檢測的靈敏度約為微量凝集試驗的16倍～128倍（表3）。

2.2.6 標準曲線與回歸方程的建立 陽性血清ELISA效價倒數(shù)的對數(shù)與血清1∶100稀釋時的OD450nm之間存在相關性，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)建立了回歸方程為ln（ET倒數(shù)）＝3.239 1OD450nm＋3.003 6，R2＝0.986 2，相關性良好。

2.2.7 RA滅活油乳劑疫苗免疫雛鴨后抗體水平對免疫過RA滅活油乳劑疫苗的雛鴨進行抗體水平動態(tài)監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，在免疫接種后7d鴨血清中的抗體含量開始有上升趨勢，在35d抗體水平檢測4份血清效價分別為1∶50、1∶50、1∶50、1∶100， 間達到高峰，之后開始下降，在免疫接種后77d左右抗體水平與免疫接種后14d的抗體水平相近（圖5）。

表1 ompA重組蛋白與鴨的其他病原抗血清的交叉試驗Table 1Cross reactivity of the recombinant ompA protein with the antisera against other pathogens in ducks

表2 重組ompA抗原的阻斷試驗結果Table 2Blocking analysis of the recombinant ompA protein with positive antisera

表3 間接ELISA和微量凝集試驗檢測RA抗體敏感性比較Table 3Comparison of sensitivity between indirect ELISA and antibody micro－agglutination test

圖5 免疫血清1型RA滅活油乳劑疫苗免疫接種后抗體水平的變化Fig 5Antibody titer after immunization of inactivated oil emulsion vaccine of Riemerella anatipestifer serotype 1

3 討論

在用間接ELISA檢測RA抗體效價的相關報道方面，胡清海［4］利用 LPS，辜新貴等［5］利用重組蛋白P25，程龍飛［6］、程安春［7］李富祥［8］等分別用全菌蛋白以及Huang B等［9］用重組蛋白P45N作為包被抗原均取得了較理想的效果。此外，Hu Q等［10］建立了m－PCR方法用來檢測RA抗原，Christensen H等［11］建立了區(qū)分RA血清型的PCR檢測方法。本研究選取了RA的ompA作為ELISA方法中的包被抗原，這是全基因組序列中相對保守的一段序列，變異較少，Hu Q［12］、Liu Y 等［13］已 經(jīng)證實ompA 是 RA 的一種毒力因子。并且ompA具有良好的免疫原性并且能誘導保護性免疫反應［14］。因此，ompA不僅具有血清學檢測價值，還可以作為亞單位疫苗的候選成分之一。試驗采用原核表達技術成功構建了重組質粒pET－28a（＋）－ompA，經(jīng)IPTG誘導成功表達ompA蛋白，原核表達的蛋白能與抗血清發(fā)生反應。經(jīng)過親和層析純化，將純化后的蛋白作為包被抗原，避免了一些雜蛋白導致的非特異性結合，減少假陽性產(chǎn)生的幾率。

關于檢測鴨血清中抗RA抗體含量的報道中，主要的檢測方法有凝集試驗、瓊脂擴散試驗以及間接熒光抗體檢測等方法。凝集試驗和瓊脂擴散試驗主要用于血清分型，且以上兩種方法靈敏度較ELISA方法低，程安春［7］等均有相關報道證明凝集試驗的敏感性遠遠低于間接ELISA方法。本研究建立的ELISA方法的敏感性是微量凝集試驗的敏感性的16倍～128倍，進一步驗證了該結論。

ompA為鴨疫里氏桿菌全基因組序列中相對保守的一段序列，變異較少，因此在理論上克隆表達的ompA蛋白應該可以檢測出多種血清型鴨疫里氏桿菌抗體水平［15］。但是本試驗室目前并未保存有其他血清型的鴨疫里氏桿菌陽性血清，這使得此部分試驗未能實施。下一步工作應盡量多收集多種血清型進行試驗，證明其是否可以同時與多種血清型的鴨疫里氏桿菌陽性血清發(fā)生反應。此外，覃志初等［16］利用間接ELISA檢測方法進行ompA蛋白單克隆抗體陽性克隆的鑒定。本課題下一步工作計劃即制備ompA單克隆抗體，進行雙夾心ELISA檢測方法檢測RA抗原。

本試驗建立的ELISA方法中分別將同批次和不同批次包被的酶標板對4份RA陽性血清進行ELISA檢測，每份血清做4個重復，變異系數(shù)在1.2%～8.8%之間，因此本試驗建立的方法重復性良好，具有穩(wěn)定性。

試驗數(shù)據(jù)顯示，在免疫后第7天鴨血清中的抗體水平開始有上升趨勢，說明在鴨體內免疫后7d開始出現(xiàn)免疫反應，隨著時間的延長，抗原緩慢釋放，抗體水平逐漸升高，在35d抗體水平達到高峰，之后開始下降，在免疫后77d左右抗體水平與免疫后14d的抗體水平相近，為保持較高的抗體水平，應在免疫后77d內進行加強免疫，但是就目前商品鴨養(yǎng)殖模式而言，此抗體水平維持時間已足夠。

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