喬宏興，張曉根，邊傳周，寧豫昌

（鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W(xué)校生物工程系，河南鄭州 450011）

豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV－2）是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）和相關(guān)疾病的重要病原，德國學(xué)者Tisher首次在PK－15細(xì)胞中發(fā)現(xiàn) PCV－2［1－2］。郎洪武等［3］對(duì)國內(nèi)7個(gè)?。ㄊ校┑?59份豬血清進(jìn)行了檢測，豬群PMWS抗體的陽性率為42.9% ，表明該病在中國很多豬場廣泛存在，并且與其他豬病毒如豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒、豬藍(lán)耳病病毒等混合感染給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失，已成為阻礙中國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要疾病之一。

PCV是一種無囊膜，直徑平均為17nm的DNA病毒［4］。PCV－2的基因組全長為1 767bp或1 768bp，這是由于1 042位（位于ORF2）核苷酸的缺失或插入造成的［5］。PCV－2含有兩個(gè)主要開放閱讀框，即ORF1和ORF2，其中ORF1編碼復(fù)制酶相關(guān)的Rep蛋白，該蛋白氨基酸序列比較保守［6］；ORF2編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白［7］，是臨床分子水平上鑒定PCV－2的重要基因。本研究利用PCR技術(shù)從所分離鑒定的PCV－2zz株克隆出ORF2基因序列，將其導(dǎo)入原核表達(dá)載體中，進(jìn)行了表達(dá)和檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體與工程菌 大腸埃希菌BL21（DE3）購自Promega公司；載體pET－32a（＋）購自 Novagen公司；各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Marker購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 主要試劑 低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白（上海生化所）；硝酸纖維素膜（Millipore公司）；HRP標(biāo)記的羊抗豬二抗（洛陽華美生物公司）；PCV－2陽性血清為經(jīng)ELISA檢測呈陽性的病豬血清，效價(jià)為1∶1 024，由鄭州牧業(yè)工程高等專科學(xué)校生物系微生物教研室提供。其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 PCV－2分離株 由鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W(xué)校生物技術(shù)教研室分離鑒定保存，命名為PCV－2 ZZ株。

1.1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)PCV－2全基因組國內(nèi)外 毒株 序 列，設(shè) 計(jì)1對(duì) 引 物，P1：5′－ATGGATCCATCACGAAACCTTGGACCCGAAAGG－3′，P2：5′－ATTCTCGAGTATTGCCAAA AGTCCCGGTCAAATT－3′，引物兩端分別加上BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)。

1.2 方法

1.2.1 ORF2基因的克隆 按照以下反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng)（50μL反應(yīng)體系）：10×buffer 5.0μL，10mmol／L dNTPs 4.0μL，20μmol／L p1 1μL，20μmol／L p2 1μL，2UTaq0.5μL，模板2μL，無菌水36.5μL，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min，94℃45s，52℃40s，72℃2min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 ORF2基因原核表達(dá)載體構(gòu)建 將PCR產(chǎn)物克隆至T載體，提取陽性重組質(zhì)粒，將陽性重組質(zhì)粒與pET－32a（＋）原核表達(dá)載體用BamHI和XhoI分別進(jìn)行雙酶切，并進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建陽性重組質(zhì)粒pETORF2，將質(zhì)粒送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。利用DNA Star軟件與已公布的PCV－2ORF2基因組序列做進(jìn)行分析，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 ORF2原核表達(dá) 將重組BL21菌按1∶100的比例加入含有氨芐（30μg／mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃條件下振蕩培養(yǎng)2h左右，當(dāng)OD值達(dá)到0.4～0.6 時(shí)加入終濃 度為 1.0mmol／L 的IPTG，30℃振蕩培養(yǎng)3h～4h誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)設(shè)空載體誘導(dǎo)對(duì)照。培養(yǎng)后各取出1mL，12 000r／min離心30s，棄上清。100℃變性3min，SDS－PAGE對(duì)表達(dá)做出初步鑒定。

1.2.4 Western blot分析 SDS－PAGE后，將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜（NC膜）上，將轉(zhuǎn)印膜放入20mL的100mL／L的脫脂奶粉中4℃過夜封閉；將轉(zhuǎn)印膜剪成單條，加入PCV－2多抗，37℃作用30min；PBS液將HRP標(biāo)記的羊抗豬二抗1∶1 000稀釋，加入NC膜上。37℃反應(yīng)30min，每次反應(yīng)后均用TBST洗滌3次，最后用AEC做顯色。當(dāng)目的條帶與本底顯色差別最大時(shí)，用水立即終止顯色。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的克隆

從病料中擴(kuò)增出大小為702bp左右的PCV－2 ORF2特異性條帶，與預(yù)期相符（圖1）。

圖1 PCV－2ORF2基因PCR產(chǎn)物Fig.1PCR product of PCV－2ORF2gene

2.2 重組質(zhì)粒pET－ORF2的雙酶切鑒定

將陽性重組質(zhì)粒用BamHI和XhoI進(jìn)行雙酶切鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果可見載體條帶5 900bp和目的條帶702bp，與預(yù)期結(jié)果一致，酶切結(jié)果見圖2，說明得到陽性重組表達(dá)質(zhì)粒。

圖2 重組質(zhì)粒pET－ORF2的酶切鑒定Fig.2Recombinant plasmid pET－ORF2identified by enzyme digestion

2.3 序列分析

測序結(jié)果表明，克隆到的ORF2基因全長為702bp，將其核苷酸序列與已發(fā)表的歐洲和北美、中國大陸、臺(tái)灣地區(qū)、日本的24株P(guān)CV毒株進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，ZZ毒株與其它地域的PCV－2毒株間的核苷酸序列同源性均在88.2%以上，其中ZZ分離毒與QD的核苷酸序列同源性達(dá)100%，表明zz株與QD株可能是在國內(nèi)引種時(shí)來自同一地方，與羅馬尼亞毒株核苷酸同源性為99.8%，與國內(nèi)其他幾株毒株II（浙江）、HZ2020（杭州）、GD－TS（廣東泰山）、ZS（廣州）、JJ（浙江）、SD（山東）、TJ（天津）、HB（河北）毒株及歐洲分離株（德國、羅馬尼亞分離株）核苷酸序列較近，形成一個(gè)分支表示親緣關(guān)系較近，這也可能與我國從歐洲引種有關(guān)。ZZ株與國內(nèi)SZ（深圳）及美國、加拿大、英國、日本毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖3）。

2.4 SDS－PAGE電泳檢測

誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物按常規(guī)方法進(jìn)行SDS－PAGE，在30ku左右處出現(xiàn)與預(yù)期大小相一致的蛋白條帶（圖4），而對(duì)照樣品則沒有。

2.5 Western blot分析

用豬PCV－2陽性血清對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體蛋白進(jìn)行Western blot分析，在大小約30ku處出現(xiàn)1條清晰的反應(yīng)條帶，對(duì)照組則無（圖5），說明表達(dá)的重組蛋白可被PCV－2多抗識(shí)別。

圖3 PCV分離毒株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3Phylogenetic tree of PCV isolates

圖4 SDS－PAGE電泳分析表達(dá)產(chǎn)物Fig.4Analysis of the expressed products by SDS－PAGE

圖5 重組蛋白的Western blot分析Fig.5Analysis of the recombinant protein by Western blot

3 討論

近年來，PCV－2在全世界范圍內(nèi)廣泛流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成的損失慘重，PCV－2能夠引起豬體免疫系統(tǒng)的損傷，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生免疫抑制，引起混合感染或繼發(fā)其他豬病的發(fā)生，易于其他病毒如豬瘟病毒、豬藍(lán)耳病病毒、偽狂犬病病毒等混合感染或繼發(fā)感染，對(duì)臨床生產(chǎn)造成的經(jīng)濟(jì)損失更大［8］。因此，如果能夠在較早時(shí)期診斷出PCV－2疾病，對(duì)豬場的疾病監(jiān)測具有重要意義［9－10］。

PCV－2基因組大小為1 768bp，包含11個(gè)開放ORF［11］，位于正鏈上的最大開放閱讀框ORF1編碼與病毒復(fù)制有關(guān)的蛋白（Rep），位于負(fù)鏈上的ORF2編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白（Cap）。Cap蛋白為病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，構(gòu)成病毒的核衣殼，在病毒感染細(xì)胞后在宿主各種酶的參與下產(chǎn)生。研究表明［12］，Cap蛋白在PCV－1與PCV－2間不發(fā)生交叉反應(yīng)，因而可用于區(qū)分PCV－1和PCV－2，且具有較好的免疫原性，其編碼基因已成為研制疫苗及檢測的首選基因［13］。在本研究中，我們克隆出702bp的ORF2片段，并進(jìn)行了原核表達(dá)，Western blot分析表明與PCV－2多抗能夠發(fā)生反應(yīng)，為進(jìn)一步研究PCV－2疫苗、制備快速診斷試劑盒提供了基礎(chǔ)。

在本研究中，設(shè)計(jì)一對(duì)引物從分離到的PCV毒株中擴(kuò)增出ORF2基因，并進(jìn)行了同源性比較和進(jìn)化分析。結(jié)果表明，ZZ株與QD株核苷酸序同源性為100%，與羅馬尼亞毒株同源性為99.8%，與另外一支德國毒株同源性為99.5%，同時(shí)和國內(nèi)其他毒株同源性較高，組成一支。從分析結(jié)果可以看出，前幾年中國一些豬場盲目從歐洲引種，導(dǎo)致PCV－2的傳入，PCV－2進(jìn)入我國后，基因趨于穩(wěn)定，但由于各地引種地點(diǎn)、養(yǎng)殖方式不同，各個(gè)毒株之間也發(fā)生了一定的變異，變異的結(jié)果對(duì)以后預(yù)防和控制PCV－2加大了難度，因此，各個(gè)地方應(yīng)加強(qiáng)疫病的防疫檢驗(yàn)工作。

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