季雅娟 王愛平 劉偉 萬喆 李若瑜

(北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心，北京100034)

外陰陰道念珠菌病 (vulvovaginal candidiasis，VVC)是一種由念珠菌引起的陰道黏膜的真菌感染。有些患者為VVC無癥狀的攜帶者，而一些患者則可能發(fā)展為頑固難治的慢性復(fù)發(fā)性外陰陰道念珠菌病 (RVVC)。治療VVC常用的抗真菌藥物主要為唑類藥物，包括氟康唑 (fluconazole，F(xiàn)LU)、伊曲康唑 (itraconazole，ITR)、咪康唑 (miconazole，MCZ)、克霉唑 (clotrimazole，CMZ)，其次為制霉菌素 (nystatin，NYS)。大量的臨床研究已經(jīng)證明，長期應(yīng)用單一的唑類藥物治療VVC容易誘導(dǎo)耐藥菌株的出現(xiàn)，而聯(lián)合用藥則能減少耐藥性的發(fā)生并減少使用大劑量單一藥物帶來的副作用。特比萘芬 (terbinafine，TEB))是丙烯胺類抗真菌藥物，具有廣譜抗真菌作用，對皮膚癬菌、酵母菌和其他霉菌有抗菌活性，對于皮膚癬菌具有殺菌效應(yīng);而對于酵母菌，根據(jù)菌種的不同特比萘芬具有殺菌或抑菌效應(yīng)，對近平滑念珠菌呈殺菌效應(yīng)［1］?；赥EB的藥效學(xué)特點，在臨床上TEB主要用于皮膚癬菌病的治療。而在國外并未開發(fā)其婦科產(chǎn)品，在我國則開發(fā)出了鹽酸特比萘芬陰道泡騰片 (50 mg/片)，臨床研究顯示其治療VVC的臨床療效與硝酸咪康唑栓的療效相似［2］。因此，為了更好的了解TEB與婦科常用的五種抗真菌藥物在體外對分離自VVC患者的念珠菌的抗菌活性以及聯(lián)合藥敏試驗，我們應(yīng)用CLSI(Clinical Laboratory Standard Institute)M27-A3［3］方案推薦的微量液體稀釋法對念珠菌的酵母相進(jìn)行了研究，希望為臨床治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

保存于北京大學(xué)真菌與真菌病研究中心的46株念珠菌均來自VVC患者分離的臨床菌株，其中白念株菌 (Candida albicans)20株，熱帶念珠菌(Candida tropical)14株，光滑念珠菌 4株(Candida glabrata)，克柔念珠菌 (Candida krusei)3株，近平滑念珠菌 (Candida parapsilosis)3株，季也蒙念珠菌 (Candida guilliermondii)1株。質(zhì)控株為近平滑念珠菌ATCC 22019。菌株的活化用改良的SDA轉(zhuǎn)種菌株2次，以保證菌株的活力。

1.2 實驗藥物

抗真菌藥物由廠家提供或購買原粉。TEB由山東齊魯制藥有限公司提供，批號960111，純度為99.9%。伊曲康唑購自山東省壽光富康制藥公司，批號20050902，純度為99.7%。咪康唑購自中國藥品生物制品檢定所，批號100213-200705，純度為99.7%?？嗣惯蛸徸悦绹鳶igma-Aldrich公司，批號16H0194，純度為99%。制霉菌素購自美國Sigma-Aldrich公司，批號087k14693V，純度為99%。上述5種藥物均用100%二甲基亞砜(DMSO)溶解，藥物濃度為1 600μg/mL。氟康唑購自美國Sigma-Aldrich公司，批號200406040，純度為98.83%，用無菌蒸餾水溶解，藥物濃度為3 200μg/mL。配好的藥物貯存液置-20℃冰箱備用。

1.3 培養(yǎng)基

改良沙堡固體培養(yǎng)基(SDA)，RPMI 1640液體培養(yǎng)基。

1.4 主要試劑和器材

RPMI 1640粉，MOPS緩沖液粉劑，DMSO，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，麥?zhǔn)媳葷峁芎捅葷醿x。

1.5 方法

菌懸液制備 從SDA培養(yǎng)基上用無菌生理鹽水收集念珠菌的孢子，并進(jìn)一步用RPMI 1640液體培養(yǎng)基稀釋至終濃度為 (1～2.5)×104CFU/mL。

藥物敏感測試板的制備 標(biāo)準(zhǔn)的液體培養(yǎng)基RPMI 1640中加入0.165 mol/L MOPS，調(diào)pH 至7.0。將 FLU、ITR、MCZ、CMZ 和 NYS的藥物母液用RPMI 1640液體培養(yǎng)基進(jìn)行10級倍比稀釋，F(xiàn)LU的藥物濃度范圍是128～0.25μg/mL，ITR和NYS的藥物濃度是32～0.06μg/mL，MCZ的藥物濃度范圍是16～0.03μg/mL，CMZ藥物濃度范圍是4～0.007 5μg/mL。將TEB的藥物母液進(jìn)行7級倍比稀釋，濃度范圍是256～4μg/mL(除近平滑念珠菌所用的藥敏板濃度范圍是4～0.06μg/mL以外)。配置藥敏板時以上各藥物濃度均為4倍應(yīng)測試藥物濃度。每次配制藥敏板時均制備質(zhì)控菌藥敏板進(jìn)行質(zhì)控，配好的藥敏板密封后放置-20℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

棋盤式微量稀釋法 藥物在體外的相互作用是通過棋盤微量液基稀釋法進(jìn)行評價的，包括判讀各個單藥的MIC值并在相同藥敏板上讀出聯(lián)合用藥后的MIC值。根據(jù)抗真菌藥物的濃度范圍將藥物分別加入到藥敏板中。培養(yǎng)板橫向以1～12列表示，即有12孔;縱向以A～H行表示，即有8孔。第1列及第H行為單獨藥敏試驗區(qū)，第2～11列及A～G行為聯(lián)合藥敏試驗區(qū)。6種藥物的儲存液分別用RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行倍比稀釋，取50μL各稀釋濃度TEB藥液分別加入A～G行各孔，取50 μL各稀釋濃度其他藥物加入1～11列。第12列加入200μL培養(yǎng)基作為陰性對照［4］。之后各孔接種制備好的菌懸液100μL，將藥敏板放置35℃恒溫培養(yǎng)箱，48 h觀察結(jié)果。

最低抑菌濃度 (minimal inhibitory concentration，MIC)的判定 采用終點判讀法觀察與生長對照相比90%［5-6］生長受抑制的最低藥物濃度為單藥的MIC值和與其他藥物聯(lián)合后的MIC值。實驗重復(fù)2次。

聯(lián)合用藥的效果評價 分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)(fractional inhibitory concentration，F(xiàn)ICI)被用于評價藥物間的相互作用。FICI值的計算方法是每一種藥物聯(lián)合用藥后的MIC值除以該單藥的MIC值，然后相加，計算出的值即為FICI值。判讀標(biāo)準(zhǔn)是［7］:當(dāng) FICI值≤0.5 時，為協(xié)同;當(dāng) 0.5 ＜ FICI≤4.0，為無關(guān);當(dāng) FICI＞4.0 時為拮抗。并計算各藥物單獨和聯(lián)合用藥時MIC的幾何均數(shù)GM。

2 結(jié) 果

2.1 抗真菌藥物對念珠菌的MIC值

TEB單藥的MIC范圍是0.5～256μg/mL，C.parapsilosis的MIC值是0.5～1 μg/mL，其余念珠菌均為256μg/mL。FLU的MIC范圍是0.5～128 μg/mL。ITR的MIC范圍是0.5～32μg/mL。MCZ的MIC范圍是0.125～16μg/mL。CMZ的MIC范圍為0.03～4μg/mL。NYS的 MIC范圍為2～8 μg/mL(見表1)。

2.2 TEB與其他5種抗真菌藥物體外藥物相互作用

對C.albicans，TEB 分別與 FLU、ITR、MCZ 和CMZ聯(lián)合，表現(xiàn)為協(xié)同作用所占比例分別為100%(20/20)、80%(16/20)、55%(11/20)和 90%(18/20)。1株 C.guilliermondii對TEB與上述四種唑類藥物的聯(lián)合均表現(xiàn)為協(xié)同;C.tropical對TEB與FLU、ITR、MCZ、CMZ聯(lián)合表現(xiàn)為協(xié)同作用的分別為 67%(10/15)、60%(9/15)、20%(3/15)、20%(3/15)。對 C.glabrata，C.krusei和 C.parapsilosis，聯(lián)合藥敏的結(jié)果顯示TEB與唑類藥物均無協(xié)同作用。TEB與NYS聯(lián)合對所有菌株均無協(xié)同作用(見表2)。

表1 6種抗真菌藥物對念珠菌的MIC值范圍及GM值(μg/mL)Tab.1 MIC ranges and geometric mean of six antifungi drugs against Candida spp(μg/mL)

表2 特比萘芬與其他藥物聯(lián)合對念珠菌協(xié)同作用的百分比 (n，%)Tab.2 Synergistic interaction of terbinafine and other drugs to Candida spp(n ，%)

3 討 論

TEB是丙稀胺類抗真菌藥物，對多種絲狀菌和其他的病原菌有良好的抗真菌活性［8］。由于有比較高的親脂特性并在皮膚組織中廣泛分布，TEB被廣泛用于多種皮膚癬菌病的治療［9-10］。但其對念珠菌屬，包括C.albicans的作用則以抑菌效應(yīng)為主，且MIC值較高。因此，臨床上對于TEB是否可以用于治療C.albicans感染還缺乏統(tǒng)一的認(rèn)識。三唑類藥物，包括FLU、ITR等，通過抑制真菌細(xì)胞膜上與麥角固醇生物合成有關(guān)的C14-羊毛甾醇脫甲基酶來發(fā)揮抗真菌作用［11］。FLU已廣泛應(yīng)用于多種念珠菌屬引起的真菌感染［12］。ITR已用于多種侵襲性真菌感染，包括念珠菌血癥［13］。MCZ和CMZ屬咪唑類抗真菌藥，作用機(jī)制是影響真菌甾醇或脂肪酸的代謝，引起毒性產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)聚集，造成代謝障礙等，從而達(dá)到抗真菌的作用。NYS可與胞膜上的固醇相結(jié)合，由此導(dǎo)致菌膜的通透性改變，胞質(zhì)內(nèi)容物外漏，導(dǎo)致菌體死亡。不同種類的藥物由于藥物作用靶點的不同，聯(lián)合后可能顯示為協(xié)同作用。

本實驗結(jié)果提示:TEB與唑類藥物聯(lián)合，對C.albicans產(chǎn)生協(xié)同作用，與國內(nèi)的一些研究結(jié)果吻合［14-15］。對 C.tropical，TEB 與唑類藥物聯(lián)合表現(xiàn)為部分協(xié)同。對于 C.glabrata，C.krusei 和 C.parapsilosis，聯(lián)合藥敏無協(xié)同作用;而 C.guilliermondii則表現(xiàn)為協(xié)同作用。但由于這些非白念株菌株數(shù)目較少，可能不能完全體現(xiàn)真實情況。因此，不同種屬的念珠菌可能對相同的藥物聯(lián)合表現(xiàn)出不同的效應(yīng)，臨床醫(yī)生可以根據(jù)菌種鑒定的結(jié)果來選擇合適的抗真菌藥物。

本實驗采用M27-A3方法測定MIC值，TEB判定值臨界點明顯，無拖尾現(xiàn)象。FLU和ITR在低濃度時對真菌起抑制作用，高濃度時才呈現(xiàn)出殺菌作用，容易出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。我們參考國外文獻(xiàn)［5-6］，對TEB和唑類藥物的單藥和聯(lián)合用藥后的MIC值均讀取與生長對照相比90%生長抑制所對應(yīng)的藥物濃度。

本研究采用念珠菌的酵母形態(tài)進(jìn)行了體外抗菌活性研究，而在臨床中念珠菌真正的致病狀態(tài)為菌絲形態(tài)。我們曾經(jīng)的體外研究結(jié)果顯示TEB對念珠菌的菌絲相MIC值明顯低于酵母相［16］，本研究亦顯示類似的結(jié)果。今后有待對念珠菌的菌絲相狀態(tài)進(jìn)行相關(guān)研究，這樣的結(jié)果可能更接近臨床疾病發(fā)病的真實過程。盡管抗真菌藥物體外MIC值與體內(nèi)實際抗菌效能相關(guān)，但并非完全平行，因此還需進(jìn)一步用動物模型和臨床療效來評價聯(lián)合用藥的療效。

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