苗琦 曹永兵 張石群 林輝 姜遠(yuǎn)英

(第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，上海200433)

真菌是自然界中廣泛存在的一種真核微生物，其中可致人體疾病的真菌大約有200多種，屬于條件致病菌［1］。近年來隨著廣譜抗生素、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，外科介入療法的逐漸增多以及腫瘤放療、化療的影響，使得原來發(fā)生率較低的深部真菌感染近年來有逐漸抬頭的趨勢［2］。在抗真菌藥物非常有限的情況下，耐藥真菌的出現(xiàn)無疑給本就步履維艱的臨床治療雪上加霜［3］。針對這一現(xiàn)象，科學(xué)家們另辟蹊徑將目光轉(zhuǎn)向了納米材料。以納米銀粒子為例，由于納米銀粒子的表面效應(yīng)，其抗真菌能力是相應(yīng)微米銀粒子的200倍以上，因而添加納米銀粒子制成的醫(yī)用敷料對諸如白念珠菌等臨床常見真菌有較好的抑制作用。本文將對近年來納米材料的抗真菌活性及其機(jī)制的研究進(jìn)展作一綜述。

1 納米材料的特性

納米材料即粒徑為1～100 nm的納米粉、納米線、厚度為1～100 nm的納米薄膜，并能出現(xiàn)納米效應(yīng)的材料［4］。由于納米材料的顆粒極其微小，使其在物理、化學(xué)、電子、生物等方面與大分子相比有顯著的特異性，因而在航天航空、醫(yī)藥、化妝品、電子及抗菌消毒等方面具有廣泛的應(yīng)用前景［5］。眾所周知，直徑小于100 nm的納米材料能夠進(jìn)入細(xì)胞;小于40 nm的納米材料可以進(jìn)入細(xì)胞核;當(dāng)小于35 nm時就可以通過血腦屏障［6］。

納米材料與同樣容積的大顆粒相比有很大的比表面積。舉例說明，如果1立方厘米切割成邊長為1 nm的1021個立方體，則切割后的總質(zhì)量和總體積不變，但是表面積卻增加了1 000萬倍［7］!圖1說明了納米粒子粒徑大小與比表面積之間成負(fù)相關(guān)的關(guān)系。正是由于這些特性使納米材料擁有很多效應(yīng):表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、體積效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)、界面相關(guān)效應(yīng)［1］。

圖1 納米粒子粒徑大小與比表面積之間成負(fù)相關(guān)的關(guān)系(例如，當(dāng)納米直徑為30 nm時比表面積值為10%左右，而當(dāng)粒徑縮小到3 nm時，比表面積增大到50%左右［8］)Fig.1 Inverse relationship between particle size and number of surface expressed molecules.For instance，in a particle of 30 nm size，about 10%of its molecules are expressed on the surface，whereas at 3 nm size the ratios increase to 50%

2 主要的納米抗真菌材料及其抗真菌機(jī)制

2.1 金屬型納米抗真菌劑

納米銀是目前研究較多的納米抗真菌材料。從遠(yuǎn)古時代，人們就知道銀及其復(fù)合物能夠有效地對抗微生物，利用銀可以加速傷口愈合、治愈感染、凈化水和保存食物飲料等［9］。Panacek 等［8］研究發(fā)現(xiàn)納米銀對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌甚至是多元耐藥菌株都有很強(qiáng)的殺菌作用。鄭叢龍等［10］的實驗結(jié)果表明納米銀對白念珠菌、黃曲霉和黑曲霉有明顯的抑制作用，使用0.06%納米銀溶液室溫下作用10 min時，對白念珠菌的抑菌率為92.0%，而對黃曲霉和黑曲霉的抑制率僅為5% ～6%。而當(dāng)室溫下作用30 min后，對白念珠菌、黃曲霉和黑曲霉的抑制率均大大提高，可以達(dá)到100%，以上實驗說明納米銀對白念珠菌、黃曲霉和黑曲霉的抑制作用與其劑量和作用時間密切相關(guān)。Kim 等［11］證明了納米銀 (MIC80，1 ～7 μg/mL)能夠抑制須癬毛癬菌以及白念珠菌臨床株和標(biāo)準(zhǔn)株的生長，其活性雖然與兩性霉素B(MIC80，1～5 μg/mL)相當(dāng)，但是比氟康唑(MIC80，30μg/mL)強(qiáng)很多，除此之外還發(fā)現(xiàn)納米銀對菌絲態(tài)的活性比酵母態(tài)強(qiáng)。

有關(guān)納米銀抗真菌作用的機(jī)制是相當(dāng)復(fù)雜的。但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為銀離子在納米銀的殺菌過程中發(fā)揮了不可磨滅的作用。Dibro等［12］的觀點認(rèn)為，納米銀顆粒的直徑非常小 (10～100 nm)，能夠憑借其獨(dú)特的尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)輕而易舉地到達(dá)細(xì)胞膜，穿透細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。由于納摩爾水平的納米銀的表面積極大，在水溶液中容易發(fā)生反應(yīng):Ag=Ag++e-。銀離子進(jìn)入病原體后迅速地與菌體中的酶蛋白巰基(-SH)結(jié)合，使一些以此為必要基團(tuán)的酶失去活性，致使細(xì)胞喪失分裂繁殖能力而死亡，從而起到了殺滅真菌、修復(fù)組織、加速傷口愈合、治療感染的作用。Feng等［13］的研究發(fā)現(xiàn)的銀離子抗菌機(jī)制為納米銀處理傷口后，銀離子可與致病菌中的DNA堿基相結(jié)合形成交叉鏈接，進(jìn)而置換嘌呤和嘧啶中與氮相鄰的氫鍵，使真菌DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，喪失復(fù)制能力，導(dǎo)致致病菌失去活性，從而達(dá)到殺滅真菌的作用。而Kim等［14］的觀點則認(rèn)為納米銀與真菌表面的蛋白質(zhì)分子發(fā)生結(jié)合，產(chǎn)生變性反應(yīng)，裂解質(zhì)子泵，使膜蛋白或磷脂雙分子層的通透性增強(qiáng)，H+容易外漏，導(dǎo)致真菌的細(xì)胞膜裂解而發(fā)揮殺菌作用。程定超等［15］認(rèn)為納米銀的抗真菌活性還與納米銀中的銀離子與真菌中的-NH、-COOH等反應(yīng)有關(guān)。

2.2 光催化型納米抗真菌劑

光催化型納米抗真菌劑是指以納米二氧化鈦為代表的，具有光催化性能的一類半導(dǎo)體無機(jī)材料，其他還包括納米氧化鋅、納米碳化硅等，以及相互之間的復(fù)合物等［16］。

納米二氧化鈦 二氧化鈦 (TiO2)是一種白色無毒的金屬氧化物，其主要有銳鈦礦、板鈦礦和金紅石三種結(jié)構(gòu)形態(tài)類型，其中銳鈦礦型TiO2具有光催化活性，尤其是它的粒徑降到納米級的時候光催化效果比微米級強(qiáng)很多，稱為納米TiO2。隆泉等［17］通過三角瓶震蕩實驗法研究發(fā)現(xiàn)，納米TiO2對金黃色葡萄球菌及白念珠菌均有抑制作用，且納米TiO2的抗菌性能明顯高于微米級的TiO2;還有實驗研究發(fā)現(xiàn)40 mg/L納米TiO2光照作用 24 h后可以滅活大部分白念珠菌［18］。Maneerat等［19］用納米 TiO2粉末和涂有 TiO2的塑料薄膜對青霉菌和腐爛的果實進(jìn)行體外實驗，將青霉菌孢子和TiO2粉末均加入到馬鈴薯葡萄糖瓊脂板(PDA)中，發(fā)現(xiàn)光催化型TiO2能夠有效地減少孢子的形成。另外，隨著TiO2量的增加，通過光催化反應(yīng)抑制青霉菌的能力越強(qiáng)，培養(yǎng)基中活的菌落數(shù)越少。因此，涂有納米TiO2的塑料薄膜可以有效減少青霉菌對檸檬、蘋果等果實的侵染。方明等［20］通過對6種不同的不溶性無機(jī)抗菌劑采用液體稀釋法發(fā)現(xiàn)，納米TiO2抗菌劑具有明顯的抗白念珠菌的功效，且納米載銀抗菌劑比納米TiO2抗菌劑抗白念珠菌效能更強(qiáng)。

納米TiO2是一種半導(dǎo)體光催化型抗菌劑，其抗真菌機(jī)制主要是納米TiO2由傳導(dǎo)電子的導(dǎo)帶、充滿電子的價帶和不能存在電子的禁帶構(gòu)成［21］，在紫外光的照射下，當(dāng)能量大于其帶隙能時，納米TiO2即自行分解產(chǎn)生帶負(fù)電的電子 (e-)和帶正電的空穴 (h+)，形成空穴-電子對，其中電子(e-)使吸附溶解在TiO2表面的O2還原形成氧原子 (·O)，而空穴 (h+)則將吸附在TiO2表面的OH-和H2O氧化成氧原子 (·O)和羥基自由基(·OH)［22］。由于羥基自由基具有強(qiáng)氧化能力，可以氧化分解構(gòu)成真菌的主要成分的各種有機(jī)物生成CO2和H2O，干擾真菌蛋白質(zhì)的合成，從而有效地抑制真菌的生長，因此具有很好的消毒殺菌的功能。同時納米TiO2作為光催化抗菌材料，在抗菌過程中僅作為催化劑，理論上沒有消耗，可重復(fù)使用。

納米氧化鋅 氧化鋅(ZnO)是一種無機(jī)金屬型氧化物，能夠補(bǔ)充人體必須的礦物元素鋅，而且納米ZnO與人體細(xì)胞有很好的組織相容性，并且具有持久耐用、高度選擇性、耐高溫等優(yōu)點。在目前研究的眾多無機(jī)金屬型氧化物 (如TiO2，MgO，CaO and ZnO等)中，ZnO由于其獨(dú)特的性質(zhì)表現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景。Deepali［23］等通過將真菌(Fusarium sp.)涂抹到含有不同濃度的納米ZnO的SDA平皿上的實驗方法，發(fā)現(xiàn)納米ZnO有明顯的抗真菌活性。

Brayner［24］認(rèn)為納米ZnO的抗真菌活性可能與其在納米結(jié)構(gòu)的表面形成了自由基有關(guān)，通過自由基破壞真菌的生物膜。2010年Lili等［25］研究了納米ZnO對P.expansum和B.cinerea的抗真菌活性，并用掃描電鏡和拉曼光譜做了相關(guān)機(jī)制研究。發(fā)現(xiàn)當(dāng)納米ZnO的濃度大于3 mmol/L時就能明顯的抑制P.expansum和B.cinerea的生長。同時還發(fā)現(xiàn)納米ZnO對兩種植物真菌的抗菌機(jī)制可能不同。納米ZnO是通過摩擦真菌B.cinerea使菌絲變形來發(fā)揮抗真菌活性，而對P.expansum則是通過抑制分生孢子的生長來抑制真菌生長。

2.3 復(fù)合型納米抗真菌劑

目前，絕大多數(shù)的納米抗真菌材料使用的是單一的納米抗菌劑，它們各自都有一定的局限性，如純度高的納米銀價格較昂貴，對正常細(xì)胞是否也具有殺傷作用等本身的毒理學(xué)與安全性問題都還有待作進(jìn)一步研究。而光催化型納米抗真菌劑如納米TiO2的殺菌功能則必須借助紫外光線才能起作用，這樣就先限制了它的應(yīng)用范圍。因此，復(fù)合型納米抗真菌劑的研究就顯得格外重要。

殼聚糖季銨鹽/有機(jī)累托石納米復(fù)合材料 王小英等［26］通過溶液插層法合成了殼聚糖季銨鹽/有機(jī)累托石納米復(fù)合材料。并通過抑菌活性實驗、殺菌實驗等發(fā)現(xiàn)在pH=5.4的醋酸緩沖溶液、水及pH=8的NaOH條件下對黃曲霉、革蘭陽性菌、革蘭陰性菌的抗菌性能都大大提高。證實了殼聚糖季銨鹽/有機(jī)累托石納米復(fù)合材料能有效結(jié)合兩者的抗菌能力，比單一物質(zhì)的抗菌性能強(qiáng)。

此外，王小英課題組還通過掃描電子顯微鏡(TEM)和透射電子顯微鏡(SEM)研究了殼聚糖季銨鹽/有機(jī)累托石納米復(fù)合材料的抗菌機(jī)制。發(fā)現(xiàn)抗菌過程為:首先，經(jīng)CTAB改性的累托石與殼聚糖季銨鹽插層復(fù)合形成的疏水性的復(fù)合材料具有高正電荷密度。一方面，正電荷有助于納米復(fù)合材料通過靜電作用與真菌相吸附。另一方面，CTAB、殼聚糖季銨鹽的疏水基團(tuán)與真菌細(xì)胞壁的脂蛋白、磷脂等親脂成分發(fā)生疏水性作用。正是這兩方面的作用使真菌能夠有效地吸附并固定到復(fù)合材料表面。然后，帶正電荷的殼聚糖季銨鹽與帶負(fù)電荷的細(xì)胞表面形成復(fù)合物，改變細(xì)胞膜的通透性，從而達(dá)到抑制真菌生長的目的［27］。

TiO2/ZnO納米復(fù)合材料 以納米TiO2為基礎(chǔ)的復(fù)合材料能夠解決單一納米TiO2必須借助紫外光線才能起作用的不足。納米ZnO由于其表面化學(xué)活性也具備了抗真菌活性，因此成為與納米TiO2相復(fù)合的不二之選。Haghighi等［28］用化學(xué)氣相沉積的方法合成了TiO2/ZnO納米復(fù)合材料，并且通過紙片擴(kuò)散等實驗證實了這種復(fù)合材料能夠在可見光下有效地光降解白念珠菌的生物膜，很好地抑制白念珠菌的繁殖。

載銀納米復(fù)合材料 載銀納米復(fù)合材料的類型多種多樣。載銀納米TiO2是納米TiO2的一種改性產(chǎn)物，利用分子活化作用，將銀嵌入銳鈦型TiO2晶體，使TiO2在光線暗處也具有抗真菌性能，從而提高納米TiO2的光催化活性。李斌等［29］采用肉湯稀釋法、測定抗菌率法等發(fā)現(xiàn)載銀納米TiO2抗菌粉對白念珠菌的最小抑菌濃度為20 mg/mL。Fe3O4被用來研究抑制引起腦部疾病的灰綠曲霉。實驗得出載銀納米Fe3O4對灰綠曲霉的MIC值為2 000 μg/mL。

載有抗真菌藥物的納米材料 將已知的具有抗真菌活性的藥物制備成納米材料是更為直接有效地提高藥物抗真菌能力的方法。朱麗君等［30］采用透析法將兩性霉素B制成兩性霉素B/聚乙二醇-聚天冬氨酸芐酯嵌段共聚物 (AmB/PEG-b-PBLA)納米膠束，并通過微量液基稀釋法發(fā)現(xiàn)AmB/PEG-b-PBLA膠束的最低抑菌濃度只有兩性霉素B注射劑的1/8～1/4，抗真菌活性明顯高于兩性霉素B注射劑 (P ＜0.05)。

3 納米材料的抗真菌研究的展望

在國內(nèi)、外的研究報道中，對各種納米材料抗真菌性能的研究較多，但是有關(guān)它們抗真菌機(jī)制的資料很少，尤其國內(nèi)的研究更薄弱，一些該方面的實驗也正處于進(jìn)行之中，因此系統(tǒng)地研究單一納米材料及復(fù)合型的納米材料 (如載銀的納米TiO2)對真菌的殺滅效果及機(jī)制探討將是一個具有突破性的發(fā)展方向。另外，現(xiàn)今的納米抗菌劑與普遍使用的有機(jī)抗菌劑相比，一個關(guān)鍵的缺陷是即效性相對較差，因此進(jìn)一步的研究也可考慮將多種抗菌材料復(fù)合或進(jìn)行材料的改性以使其快速殺菌，從而也使納米技術(shù)與消毒滅菌技術(shù)的結(jié)合應(yīng)用更加完善。

美國伯明翰大學(xué)的菲力普教授指出:“納米技術(shù)最終目的還在于生活本身。”全世界的科學(xué)家已經(jīng)把目光轉(zhuǎn)向納米技術(shù)在人們生活中的應(yīng)用，尤其是在提高人們生活質(zhì)量的生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究。在現(xiàn)有研究成果的基礎(chǔ)上一定會研究出更多，更有效的抗真菌納米材料，為臨床真菌的治療提供更廣闊的應(yīng)用前景。

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