段紹斌, 汪 翩, 劉 芳, 王娜娜, 潘 鵬, 劉改靈, 許向青, 王予慧,劉伏友, 凌光輝, 李 瑛

（中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院腎內(nèi)科, 長(zhǎng)沙 410011）

臨床上約10%的急性腎損傷（acute kidney injury,AKI）由對(duì)比劑所致, 對(duì)比劑急性腎損傷（contrastinduced acute kidney injury, CI-AKI）已成為當(dāng)前院內(nèi) AKI的第三大原因[1]。臨床研究顯示, 原有腎臟損害、糖尿病腎病、對(duì)比劑的滲透性和劑量、充血性心力衰竭、老年（＞70歲）是 CI-AKI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2,3]; 但老齡作為 CI-AKI獨(dú)立危險(xiǎn)因素尚無(wú)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究的文獻(xiàn)證實(shí), 且作用機(jī)制尚不清楚。

目前大部分學(xué)者認(rèn)為, CI-AKI發(fā)病機(jī)制與腎缺血、氧化性應(yīng)激和直接腎小管毒性有關(guān)[2]。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme, ACE）是腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin angiotensin system,RAS）中一個(gè)關(guān)鍵酶, 現(xiàn)有的研究表明, 正常腎功能患者造影后血、尿ACE活性明顯升高[4]; 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑和血管緊張素受體拮抗劑對(duì)CI-AKI有一定的保護(hù)作用[5,6]。

Sp1蛋白為鋅指家族中一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子,在多種組織中廣泛表達(dá), 與細(xì)胞增殖、凋亡、分化、炎癥修復(fù)和新生物的轉(zhuǎn)化過(guò)程等密切相關(guān)[7]。但是,注射對(duì)比劑后腎臟局部組織中ACE活性的變化及Sp1在CI-AKI發(fā)病中的作用均未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究主要探討年齡對(duì)大鼠碘對(duì)比劑急性腎損傷的影響,探討氧化性應(yīng)激、腎組織ACE和核轉(zhuǎn)錄因子Sp1在增齡大鼠碘對(duì)比劑急性腎損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Sp1一抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司, N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-D-glocosaminidase, NAG）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司, 脂質(zhì)過(guò)氧化物丙二醛（malonaldehyde, MDA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所, ACE測(cè)定試劑盒（紫外法）購(gòu)自北京海軍總醫(yī)院, 免疫組織化學(xué)二抗試劑盒購(gòu)自深圳生物晶美科技有限公司, 76%泛影葡胺購(gòu)自上海信宜制藥廠, BCA試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

36只健康雄性SD大鼠（購(gòu)自中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）根據(jù)月齡分為 4月齡、12月齡和24月齡組, 每組12只, 各年齡組大鼠再隨機(jī)分為正常對(duì)照組和對(duì)比劑組, 每組6只。禁水24 h后, 對(duì)比劑組大鼠尾靜脈注射碘對(duì)比劑 76%泛影葡胺（10 ml/kg）, 對(duì)照組大鼠尾靜脈注射等量生理鹽水, 分別收集注射前和注射后24 h尿液測(cè)尿NAG酶; 收集注射后 24～48 h期間 24 h尿液測(cè)尿肌酐（urine creatinine, UCr）; 注射后48 h, 采用10%水合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射麻醉, 腹主動(dòng)脈采血后處死大鼠。

1.3 血尿生化指標(biāo)檢測(cè)

自動(dòng)生化分析儀（Beckmen Synchron CX3,USA）測(cè)定血清肌酐（serum creatinine, SCr）水平; 采用堿性苦味酸法測(cè)定尿肌酐; 內(nèi)生肌酐清除率（endogenous creatinine clearance rate, Ccr）=每分鐘尿量（ml/min）×尿肌酐濃度（mg/dl）/血清肌酐濃度（mg/dl）。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書采用比色法測(cè)定尿NAG酶。

1.4 腎組織勻漿MDA含量和ACE活性測(cè)定

取0.2g腎皮質(zhì)組織, 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書制備腎組織勻漿液, 采用硫代巴比妥法測(cè)定腎組織 MDA含量, 采用馬尿酰甘氨酰苷氨酸法測(cè)定腎組織 ACE活性, 組織蛋白濃度采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定; 腎組織MDA含量和ACE活性均以蛋白質(zhì)量進(jìn)行校正。

1.5 腎臟組織病理形態(tài)學(xué)觀察

取大鼠右側(cè)腎臟下極組織包括皮質(zhì)和髓質(zhì), 用10%中性福爾馬林固定12～24 h, 常規(guī)脫水, 石蠟包埋, 3 μm切片, HE染色, 光鏡檢查每組腎臟病理標(biāo)本的變化并根據(jù)Capasso等[8]采用的腎小管損傷的半定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。

1.6 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子 Sp1蛋白在腎臟組織的表達(dá)

常規(guī)石蠟切片, 二甲苯脫蠟, 100%～75%乙醇梯度脫水, 用檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原熱修復(fù), 加兔抗大鼠一抗Sp1（1:200）, 4℃過(guò)夜, 37℃恒溫烤箱復(fù)溫30 min, 加生物素標(biāo)記的二抗, DAB顯色, 蘇木素復(fù)染, PBS緩沖液為陰性對(duì)照, 光鏡下觀察Sp1抗體染色陽(yáng)性的細(xì)胞。采用Image-Pro Plus 6.0在200倍視野下進(jìn)行免疫組化染色圖像分析。陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色, 每張切片隨機(jī)選取10個(gè)不含腎小球的互不重疊視野分析各視野下陽(yáng)性目標(biāo)光密度和陽(yáng)性面積百分比代表待測(cè)抗原的量; 每個(gè)樣本重復(fù) 3次, 取其均數(shù)作為統(tǒng)計(jì)分析的原始數(shù)據(jù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 同年齡段組資料比較采用組間t檢驗(yàn), 不同年齡段組資料組間比較采用單因素方差分析, 多個(gè)樣本之間的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血、尿生化指標(biāo)的變化

表1結(jié)果表明, 4月齡鼠對(duì)比劑組與對(duì)照組比較,Scr、Ccr和注射對(duì)比劑前后24 h NAG酶水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）; 12月齡鼠對(duì)比劑組與對(duì)照組比較, Scr水平差異有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.05）, 但升高幅度小于其對(duì)照組的25%; 24月齡鼠對(duì)比劑組與對(duì)照組比較, Scr水平明顯升高（P＜0.01）, 且Scr平均值的升高幅度超過(guò)其對(duì)照組的25%, Ccr明顯降低（P＜0.05）, 注射對(duì)比劑后24 h尿NAG酶水平較注射造影前明顯升高（P＜0.001; 表1, 表2）。

表1 各組大鼠注射對(duì)比劑或生理鹽水后Scr和Ccr的比較Table 1 Scr and Ccr after injection of contrast media or normalsaline in rats of different groups (n = 6,±s)

表1 各組大鼠注射對(duì)比劑或生理鹽水后Scr和Ccr的比較Table 1 Scr and Ccr after injection of contrast media or normalsaline in rats of different groups (n = 6,±s)

注: Scr: 血清肌酐; Ccr: 內(nèi)生肌酐清除率。與同月齡鼠對(duì)照組比較, *P＜0.05, **P＜0.01

月齡 組別 體質(zhì)量(g) Scr(μmol/L) Ccr(ml·100g/min)4月齡 對(duì)照組 257.5±24.85 24.13±1.48 0.45±0.02 12月齡對(duì)比劑組 255.8±21.54 27.97±3.05 0.44±0.03對(duì)照組 536.7±58.28 31.42±1.76 0.43±0.02 24月齡對(duì)比劑組 531.7±68.24 35.15±2.08* 0.42±0.02對(duì)照組 610.0±79.12 30.53±1.94 0.43±0.02對(duì)比劑組 585.5±70.24 38.53±4.53** 0.39±0.03*

表2 各組大鼠注射對(duì)比劑或生理鹽水前后尿NAG酶的變化Table 2 Urinary NAG before and after injection of contrast or normal saline in rats of different groups (n = 6, U/L,±s)

表2 各組大鼠注射對(duì)比劑或生理鹽水前后尿NAG酶的變化Table 2 Urinary NAG before and after injection of contrast or normal saline in rats of different groups (n = 6, U/L,±s)

注: NAG: N-乙醇-b-D-氨基葡萄糖苷酶。與注射前比較,**P＜0.01

月齡 組別 注射前 注射后4月齡 對(duì)照組 14.82±2.12 15.24±2.24 12月齡對(duì)比劑組 15.46±2.84 16.61±2.92對(duì)照組 16.43±3.05 17.69±3.54 24月齡對(duì)比劑組 16.73±3.02 19.13±3.12對(duì)照組 17.71±2.42 19.24±2.90對(duì)比劑組 17.80±3.03 25.18±3.33**

2.2 各組大鼠腎組織勻漿 MDA含量和 ACE活性的變化

表3結(jié)果表明, 4月齡鼠和12月齡鼠對(duì)比劑組分別和相應(yīng)的對(duì)照組比較, 腎組織ACE和MDA水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）; 24月齡鼠對(duì)比劑組腎組織ACE和MDA水平均顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。

表3 各組大鼠腎組織勻漿液MDA含量和ACE活性的變化Table 3 MDA level and ACE activity of renal tissue of rats in different groups (n = 6,±s)

表3 各組大鼠腎組織勻漿液MDA含量和ACE活性的變化Table 3 MDA level and ACE activity of renal tissue of rats in different groups (n = 6,±s)

注: ACE: 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶; MDA: 丙二醛。與同月齡鼠對(duì)照組比較, **P＜0.01; 與24月齡鼠對(duì)比劑組比較, ##P＜0.01

月齡 組別 ACE (U/mg prot) MDA (nmol/mg prot)4月齡 對(duì)照組 1.75±0.71 2.90±0.69 12月齡對(duì)比劑組 2.10±0.84## 3.24±0.60##對(duì)照組 2.81±1.15 3.35±0.91 24月齡對(duì)比劑組 4.10±1.69## 3.89±1.16##對(duì)照組 2.61±0.49 5.43±1.53對(duì)比劑組 7.84±2.19** 7.65±2.03**

2.3 各組大鼠腎組織病理變化

HE染色結(jié)果提示, 4月齡鼠和12月齡鼠對(duì)照組腎小管、腎小球、腎間質(zhì)區(qū)結(jié)構(gòu)大致正常, 24月齡鼠對(duì)照組可見(jiàn)腎小球肥大、局灶腎小管上皮細(xì)胞空泡變性及腎小管上皮細(xì)胞萎縮; 4月齡鼠對(duì)比劑組和12月齡鼠造影組分別與相應(yīng)對(duì)照組比較, 可見(jiàn)局灶腎小管上皮細(xì)胞空泡變性, 腎間質(zhì)輕微水腫, 24月齡鼠對(duì)比劑組可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞空泡變性, 管腔明顯擴(kuò)大, 刷狀緣丟失, 大量上皮細(xì)胞核脫落,部分小管上皮細(xì)胞壞死（圖1）。

半定量分析結(jié)果顯示, 4月齡鼠和12月齡鼠對(duì)比劑組分別與相應(yīng)對(duì)照組比較, 腎小管損傷分?jǐn)?shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）, 24月齡鼠對(duì)比劑組腎小管損傷分?jǐn)?shù)明顯高于其他組（P＜0.01; 表4）。

2.4 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各組大鼠腎組織 Sp1蛋白表達(dá)的變化

4月齡鼠對(duì)比劑組與12月齡鼠對(duì)比劑組分別與相應(yīng)的對(duì)照組比較, Sp1蛋白表達(dá)均無(wú)明顯差異（P＞0.05）; 24月齡對(duì)比劑鼠腎組織Sp1蛋白陽(yáng)性表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.05; 圖2）。

2.5 24月齡鼠對(duì)比劑組腎組織 Sp1蛋白表達(dá)、MDA含量、ACE活性與SCr和腎小管損傷分?jǐn)?shù)的相關(guān)分析

相關(guān)分析結(jié)果顯示, 24月齡鼠對(duì)比劑組腎組織Sp1蛋白表達(dá)、MDA含量、ACE活性均與Scr、腎小管損傷分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)（γ = 0.877, γ = 0.897, γ = 0.845,P＜0.05; γ = 0.819, γ = 0.820, γ = 0.816,P＜0.05）。

圖1 各組腎臟病理改變Figure 1 Pathological changes of kidney in rats of different groups (HE ×200)

表4 各組大鼠腎小管損傷分?jǐn)?shù)Table 4 Renal tubular injury score of rats in different groups (n = 6,±s)

表4 各組大鼠腎小管損傷分?jǐn)?shù)Table 4 Renal tubular injury score of rats in different groups (n = 6,±s)

注: 與同月齡鼠對(duì)照組比較, *P＜0.05; 與24月齡鼠對(duì)比劑組比較, ##P＜0.01

月齡 組別 腎小管損傷分?jǐn)?shù)4月齡 對(duì)照組 0.12±0.03對(duì)比劑組 0.14±0.04##對(duì)照組 0.22±0.03 12月齡對(duì)比劑組 0.25±0.04##對(duì)照組 1.26±0.17 24月齡對(duì)比劑組 3.46±0.68*

圖2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組大鼠腎臟組織Sp1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率Figure 2 Expression rate of Sp1 protein assessed withimmunohistochemical method

3 討 論

CI-AKI是X線對(duì)比劑使用后嚴(yán)重并發(fā)癥之一,2010年歐洲泌尿系統(tǒng)放射學(xué)會(huì)對(duì)比劑安全委員會(huì)對(duì)1999年對(duì)比劑急性腎損傷指南進(jìn)行更新, 提出年齡大于70歲是CI-AKI的危險(xiǎn)因素[2]。但另有研究表明,年齡不是CI-AKI的危險(xiǎn)因素[9,10]。本研究表明, 24月齡鼠注射對(duì)比劑后, SCr顯著升高, 且升高幅度超過(guò)同組對(duì)照鼠的25%, Ccr明顯降低, 注射對(duì)比劑后 24 h尿 NAG酶水平較注射造影劑前明顯升高,腎組織出現(xiàn)明顯損害, 腎小管損傷分?jǐn)?shù)明顯升高;而 12月齡鼠注射對(duì)比劑后, Scr雖然明顯上升, 但升高幅度小于同組對(duì)照鼠的 25%; 4月齡鼠注射對(duì)比劑后與其對(duì)照鼠比較, 上述各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)明顯變化, 提示年齡是促進(jìn)雄性大鼠對(duì)比劑急性腎損傷的危險(xiǎn)因素, 進(jìn)一步支持老齡是CI-AKI的危險(xiǎn)因素。

目前大部分學(xué)者認(rèn)為, 對(duì)比劑急性腎損傷的發(fā)病機(jī)制與腎缺血、直接腎毒性及氧化性應(yīng)激有關(guān)。Gupta等[11]認(rèn)為對(duì)比劑引起腎臟血流量下降可能與RAS的活性增高引起的腎血管收縮有關(guān); Gami等[12]通過(guò)復(fù)習(xí)文獻(xiàn)指出, AngⅡ可能參與了對(duì)比劑引起的腎血管收縮。ACE是RAS中一個(gè)關(guān)鍵酶, 正常腎臟組織ACE主要定位于近曲小管刷狀緣, 較少存在于腎小球, 組織損傷可以導(dǎo)致 ACE活性的變化。本課題組過(guò)去的研究發(fā)現(xiàn), 在注射對(duì)比劑后24 h和48 h,患者血、尿 ACE活性明顯升高[4]; 對(duì)比劑可導(dǎo)致腎臟局部 AngⅡ水平的明顯升高, 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑和血管緊張素受體拮抗劑對(duì) CI-AKI有保護(hù)作用[5,6]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察到, 24月齡鼠注射對(duì)比劑后腎組織 ACE活性顯著升高, 腎組織 ACE活性與SCr、腎小管損傷分?jǐn)?shù)呈顯著正相關(guān), 提示腎臟局部ACE激活在24月齡鼠CI-AKI中起一定作用。其機(jī)理可能是對(duì)比劑促使腎臟局部ACE活性增強(qiáng), 激活腎臟RAS系統(tǒng), 導(dǎo)致腎臟組織局部AngⅡ急性升高, 引起腎臟血管收縮, 加重氧化性應(yīng)激導(dǎo)致的腎臟損害。

氧化性應(yīng)激在對(duì)比劑腎病發(fā)生發(fā)展中的作用已引起廣泛關(guān)注, 活性氧可增加腎小球入球動(dòng)脈阻力和腎小球出球動(dòng)脈阻力, 且腎小球入球動(dòng)脈阻力＞腎小球出球動(dòng)脈阻力, 因而降低了腎小球超濾系數(shù),加劇了對(duì)比劑引起的腎缺血[13]。本課題組過(guò)去的研究表明, 對(duì)比劑可引起腎組織勻漿液中 MDA水平增高[14]; 本研究結(jié)果進(jìn)一步提示, 24月齡鼠注射對(duì)比劑后, 腎組織MDA水平較同組對(duì)照鼠及4月齡和12月齡對(duì)比劑大鼠均明顯增高, 腎臟出現(xiàn)明顯病理?yè)p害, 腎組織MDA含量分別與SCr和腎小管損傷分?jǐn)?shù)呈正相關(guān), 提示氧化性應(yīng)激在 24月齡鼠 CI-AKI發(fā)病機(jī)制中亦起一定作用。

Sp1蛋白是鋅指家族中一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子,與細(xì)胞增殖、凋亡、分化、炎癥修復(fù)和新生物的轉(zhuǎn)化過(guò)程等密切相關(guān)[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn), 24月齡鼠注射對(duì)比劑后腎組織Sp1蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯升高,腎臟局部 Sp1蛋白與 SCr、腎小管損傷分?jǐn)?shù)呈正相關(guān), 提示Sp1可能在老年CI-AKI中起一定作用。

綜上所述, 增齡是對(duì)比劑急性腎損傷的危險(xiǎn)因素, 其發(fā)病機(jī)制除與腎缺血、氧化性應(yīng)激、腎組織Sp1蛋白高表達(dá)等因素有關(guān)外, 可能還與隨著年齡的增長(zhǎng), 腎臟的儲(chǔ)備能力下降、不同程度的周圍血管硬化、腎血流量改變、機(jī)體調(diào)節(jié)功能差、對(duì)急性外源性損傷因素的抵抗能力降低、對(duì)許多易致急性腎衰竭的危險(xiǎn)因素的敏感性增高有關(guān)。

[1]Cronin RE. Contrast-induced nephropathy: pathogenesis and prevention[J]. Pediatr Nephrol, 2010, 25(2): 191-204.

[2]Stacul F, van der Molen AJ, Reimer P,et al. Contrast induced nephropathy: updated ESUR Contrast Media Safety Committee guidelines[J]. Eur Radiol, 2011, 21(12): 2527-2541.

[3]Mehran R, Aymong ED, Nikolsky E,et al. A simple risk score for prediction of contrast-induced nephropathy after percutaneous coronary intervention: development and initial validation[J]. J Am Coll Cardiol, 2004, 44(7): 1393-1399.

[4]Duan SB, Wu HW, Luo JA,et al. Assessment of renal function in the early stages of nephrotoxicity induced by iodinated contrast media[J]. Nephron, 1999, 83(2): 122-125.

[5]Duan SB, Wang YH, Liu FY,et al. The protective role of telmisartan against nephrotoxicity induced by X-ray contrast media in rat model[J]. Acta Radiol, 2009, 50(7): 754-759.

[6]段紹斌, 鄒 琴, 李英娟, 等. 高滲和低滲對(duì)比劑腎毒性及福辛普利或替米沙坦的保護(hù)作用[J]. 中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2007, 32(5): 812-818.

[7]Ishibashi H, Nakagawa K, Onimaru M,et al. Sp1 decoy transfected to carcinoma cells suppresses the expression of vascular endothelial growth factor, transforming growth factor beta1, and tissue factor and also cell growth and invasion activities[J]. Cancer Res, 2000, 60(22): 6531-6536.

[8]Capasso G, Di Gennaro CI, Della Ragione F,et al.In vivoeffect of the natural antioxidant hydroxytyrosol on cyclosporine nephrotoxicity in rats[J]. Nephrol Dial Transplant, 2008,23(4): 1186-1195.

[9]Pakfetrat M, Nikoo MH, Malekmakan L,et al, Risk factors for contrast-related acute kidney injury according to risk,injury, failure, loss, and end-stage criteria in patients with coronary interventions[J]. Iran J Kidney Dis, 2010, 4(2):116-122.

[10]李美花, 范 利. 老年人造影劑腎病及臨床相關(guān)因素分析[J].中國(guó)老年醫(yī)學(xué)雜志, 2005, 25(6): 649-650.

[11]Gupta RK, Kapoor A, Tewari S,et al. Captopril for prevention of contrast-induced nephropathy in diabetic patients: a randomised study[J]. Indian Heart J, 1999, 51(5):521-526.

[12]Gami AS, Garovic VD. Contrast nephropathy after coronary angiography[J]. Mayo Clin Proc, 2004, 79(2): 211-219.

[13]Pflueger A, Abramowitz D, Calvin AD,et al. Role of oxidative stress in contrast-induced acute kidney injury in diabetes mellitus[J]. Med Sci Monit, 2009, 15(6): 125-136.

[14]Duan SB, Liu FY, Luo JA,et al. Nephrotoxicity of high- and low-osmolar contrast media. The protective role of amlodipine in a rat model[J]. Acta Radiol, 2000, 41(5):503-507.