在腫脹技術(shù)注射器吸脂和傳統(tǒng)單純自體顆粒脂肪注射填充移植[1]及脂肪組織源性干細(xì)胞（adipose derived stem cells，ADSCs）等[2]實驗與臨床研究基礎(chǔ)上，2006年，Matsumoto等[3]提出ADSCs協(xié)同自體脂肪移植（cell-assist ed lipotransfer，CAL）概念，Yoshimura等[4]同期應(yīng)用CAL成功進(jìn)行了臨床隆乳術(shù)；2008年，劉乃軍等[5]在上述CAL基礎(chǔ)上，提出干性CAL和濕性CAL概念，并應(yīng)用濕性CAL技術(shù)成功進(jìn)行了臨床多量自體顆粒脂肪移植，臨床獲得明顯提高[6]?，F(xiàn)就ADSCs技術(shù)在臨床顆粒脂肪注射移植方面的研究進(jìn)展綜述如下。

1傳統(tǒng)單純干性和濕性顆粒脂肪注射移植方法

過去27年里，在濕性腫脹技術(shù)和注射器吸脂等基礎(chǔ)上[7]，傳統(tǒng)單純自體顆粒脂肪注射移植方法分為（離心法）干性移植法[8-9]（應(yīng)用離心技術(shù)分離濃縮純化顆粒脂肪）和（靜置法）濕性移植法[10-11]（不用離心技術(shù)而是采用自然靜置懸浮反復(fù)漂洗析出水分等雜質(zhì)純化顆粒脂肪）；迄今兩者仍是臨床最常用的操作流程，公認(rèn)為安全、有效的治療方法，但有關(guān)顆粒脂肪注射移植術(shù)后存活率各家報道不一，且爭議較大，要真正建立公認(rèn)的臨床規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，仍需做出更多改進(jìn)[12-13]，目前，我國自體顆粒脂肪注射填充移植技術(shù)已經(jīng)進(jìn)入世界先進(jìn)行列。

2自體ADSCs和SVF來源

近年研究證實，在人體吸脂顆粒脂肪懸液中獲取的多向分化ADSCs是安全理想的自體細(xì)胞來源[14]，2007年，朱茗和高建華等[15]實驗研究從成人脂肪抽吸物液體部分中分離得到大量可為脂肪組織工程所利用的ADSCs，其細(xì)胞量與脂質(zhì)來源的量基本相同。2009年，Yoshimura等[16-17]實驗研究吸脂抽吸物獲得大量自體血管基質(zhì)層片段細(xì)胞（stromal vascular fraction，SVF）。2010年，付冰川和高建華[18]等實驗研究認(rèn)為新鮮SVF與培養(yǎng)的ADSCs一樣，可提高脂肪移植物存活率，前者操作更方便、省時、安全、高效，后者難以滿足臨床實際需要；其實，通過吸脂術(shù)獲得顆粒脂肪內(nèi)血管間質(zhì)碎片（SVF）“微?！焙卸喾N類型多功能干細(xì)胞，其中就包括ADSCs，新鮮SVF直接添加到顆粒脂肪移植混合填充物中，不需額外處理，對顆粒脂肪移植混合填充物較少人工處理，更能改善脂肪細(xì)胞、ADSCs、SVF活性，額外人工處理純化方法與脂肪細(xì)胞、ADSCs、SVF的細(xì)胞數(shù)量和活性無關(guān)，新鮮ADSCs和SVF可自然混合在顆粒脂肪移植填充物中，直接注射填充移植為脂肪組織工程所利用[19]；目前，雖很難證實新鮮ADSCs和SVF細(xì)胞準(zhǔn)確數(shù)量及對體內(nèi)移植顆粒脂肪在構(gòu)建脂肪組織過程中確切輔助作用機(jī)制，關(guān)鍵是可避免體外離心濃縮及分離培養(yǎng)ADSCs和SVF過程中可能出現(xiàn)細(xì)胞基因變異問題[20]。關(guān)于ADSCs的應(yīng)用，目前仍有許多重要問題有待探索解決，首先ADSCs在無免疫力的移植受體上表現(xiàn)出的腫瘤樣無限增生特性，在進(jìn)入臨床實驗前仍需尋找并建立合適動物模型進(jìn)行長期觀測以確定其移植后安全性；其次，在批量提取生產(chǎn)ADSCs過程中，如何保障細(xì)胞質(zhì)量均一穩(wěn)定仍然有待深入研究。

3離心法與靜置法對ADSCs和SVF的影響

對于吸脂抽吸物是否需要離心，迄今仍有很大爭議，一些學(xué)者一直倡導(dǎo)采用自然靜置懸浮漂洗或不漂洗法，另外一些學(xué)者則主張離心分離濃縮純化法；目前臨床還無公認(rèn)合理的離心速度，Kurita 等[22]認(rèn)為過快離心速度反而會破壞ADSCs完整性[21]；楊東運(yùn)等認(rèn)為低速離心并不能顯著提高面部自體顆粒脂肪移植存活率；雷華等[23]認(rèn)為大于等于600rpm均會損傷顆粒脂肪活性，建議顆粒脂肪移植慎用離心法，宜采用靜置法，以最大程度保護(hù)顆粒脂肪免受損傷。2011年，Botti等[24]經(jīng)長期臨床驗證認(rèn)為注射移植的顆粒脂肪細(xì)胞其吸收、存活情況與脂肪離心分離濃縮純化技術(shù)無關(guān)。研究表明，顆粒脂肪離心分離濃縮純化方法與細(xì)胞數(shù)量和活性無關(guān)，注射器法吸脂吸出的顆粒脂肪不必進(jìn)行離心和漂洗，宜采取自然靜置懸浮法析出無用水分和雜質(zhì)，最大程度保護(hù)顆粒脂肪混合填充物免受損傷[25]。

4ADSCs和SVF體外提取分離培養(yǎng)過程及存在問題

ADSCs和SVF體外分離、提取、培養(yǎng)、制作、注射為一體的處理過程均需在高標(biāo)準(zhǔn)無菌手術(shù)室和凈化室采用專用設(shè)備完成[26]。操作復(fù)雜繁瑣成本高，ADSCs誘導(dǎo)液常含有與腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移有關(guān)的生長因子，且價格昂貴不易推廣普及[27]。將離心濃縮純化后顆粒脂肪與體外分離、培養(yǎng)的ADSCs和SVF細(xì)胞混合填充物復(fù)合同步移植，該項技術(shù)尚不成熟，目前仍處于進(jìn)一步研究階段。關(guān)于ADSCs和SVF的臨床應(yīng)用，目前仍有許多重要問題有待探索解決，《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010年修訂）》（簡稱新版藥品GMP） 認(rèn)為干細(xì)胞治療需要嚴(yán)格按照藥物研發(fā)的一般流程，包括研發(fā)篩選、臨床前研究、臨床階段、新藥批準(zhǔn)上市幾個主要階段[28]，當(dāng)前FDA和SFDA還未批準(zhǔn)分離培養(yǎng)的ADSCs和SVF用于任何臨床領(lǐng)域。目前為止，干性CAL技術(shù)主要是在體外細(xì)胞培養(yǎng)皿及試管中或動物身上進(jìn)行實驗研究，須經(jīng)由嚴(yán)謹(jǐn)人體試驗證實，不但要有穩(wěn)定成活率和肯定療效，而且還要有標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一的質(zhì)量控制和臨床治療規(guī)范化管理，只能允許有限的人體可忍受，不影響健康的副作用和無嚴(yán)重并發(fā)癥發(fā)生，不改變受植區(qū)組織結(jié)構(gòu)、不干擾受植區(qū)成像、不影響受植區(qū)惡性腫瘤篩查、不干擾受植區(qū)惡性腫瘤診斷，在這些條件完全具備后方可臨床推廣應(yīng)用。干性CAL目前在臨床治療上并沒有太大實際價值，進(jìn)入臨床應(yīng)用前仍需慎之又慎，切勿盲目過早開展臨床應(yīng)用。進(jìn)入臨床試驗前仍需尋找并建立合適動物模型進(jìn)行長期觀測以確定其移植后安全性，特別是目前還無法保證經(jīng)離心后體外分離培養(yǎng)的ADSCs和SVF是否出現(xiàn)細(xì)胞基因變異瘤化問題；有研究顯示，長時間培養(yǎng)的ADSCs可使免疫缺陷小鼠發(fā)生腫瘤[29-30]。目前尚無一安全穩(wěn)定并行之有效的培養(yǎng)、誘導(dǎo)方式，以及在批量提取生產(chǎn)ADSCs和SVF過程中，如何保障細(xì)胞質(zhì)量均一穩(wěn)定性，有待進(jìn)一步研究。

5干性CAL和濕性CAL主要區(qū)別及臨床效果

主要區(qū)別在于干性CAL是應(yīng)用離心技術(shù)分離濃縮純化自體顆粒脂肪及體外分離、培養(yǎng)ADSCs和SVF，手術(shù)需二次完成，難以滿足臨床需要，還沒有經(jīng)過嚴(yán)格循證醫(yī)學(xué)的臨床對照研究檢驗，另外還有一些倫理道德方面問題需探討。劉曉燕等[31]臨床應(yīng)用ADSCs（干性CAL）治療面部老化癥和面部凹陷癥，局部癥狀明顯改善，但長期效果尚待進(jìn)一步觀察。濕性CAL是不用離心技術(shù)去除吸脂抽吸物液體和脂質(zhì)中大量ADSCs和SVF，不體外分離培養(yǎng)ADSCs和SVF（注射器內(nèi)自然靜置懸浮不漂洗法），新鮮ADSCs和SVF自然混合在顆粒脂肪填充物中直接注射移植，手術(shù)可一期完成，操作簡易、快速、安全、經(jīng)濟(jì)、并發(fā)癥少；濕性CAL是未離心分離培養(yǎng)的新鮮ADSCs和SVF“微?！迸c顆粒脂肪混合填充物復(fù)合同步移植，臨床技術(shù)基本成熟，規(guī)避了許多體外培養(yǎng)細(xì)胞移植倫理道德方面問題，經(jīng)過了嚴(yán)格循證醫(yī)學(xué)的臨床對照研究和檢驗，有26年傳統(tǒng)單純自體顆粒脂肪（干性/濕性）注射移植經(jīng)驗可借鑒[32]。

2011年，魯峰[33]采用新鮮獲得SVF，不體外分離、培養(yǎng)ADSCs和SVF，一次完成臨床手術(shù)，治療11例，認(rèn)為新鮮干細(xì)胞輔助能提高游離移植脂肪組織存活率，是一種安全有效的治療軟組織缺損方法。除此之外，干性CAL和濕性CAL在抽取顆粒脂肪和注射移植過程中均符合“三低三多” 顆粒脂肪注射移植原則和“3L3M”技術(shù)規(guī)則[34]。如果干性CAL效果并不優(yōu)于濕性CAL，那我們一定更愿意選擇操作簡便、效果安全可靠的濕性CAL方法，濕性CAL初步解決了制約單次多量顆粒脂肪注射移植術(shù)后存活率的重要難題，公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)化濕性CAL操作流程應(yīng)該是：①吸脂術(shù)：采用手工注射器注射腫脹液（盡量避免壓力過高過快）和注射器吸脂法；②制備新鮮濕性顆粒脂肪及干細(xì)胞“微粒”混合填充物：20ml螺口專用一次性注射器和1.5～2mm無創(chuàng)吸脂針吸脂，每次吸滿一支注射器畢，將注射器直立自然靜置懸浮后只排出注射器內(nèi)顆粒脂肪下層少許水分（若水分很少，亦可不排出），不撥除注射器芯，將吸脂抽吸物由注射器桶后口傾倒入生理鹽水盆中懸浮漂洗顆粒脂肪抽吸物，不排出靜置后注射器內(nèi)顆粒脂肪上層脂質(zhì)（油脂）部分，不離心濃縮純化分離顆粒脂肪和干細(xì)胞“微?！?，不排出注射器內(nèi)自然靜置后混合填充物微粒間液體部分（因其內(nèi)富含未經(jīng)分離新鮮ADSCs和SVF），直接注射填充移植用；③濕性CAL隆乳和隆臀及隆乳假體取出后即刻注射隆乳術(shù)：注射移植前受區(qū)先局部腫脹浸潤麻醉（0.125%鹽酸利多卡因含1：1000000腎上腺素溶液） 使各層次組織液壓膨脹和疏松無創(chuàng)分離，并根據(jù)注射腫脹液體積量計算出濕性填充物微粒注射需要量，實際注射量要比受區(qū)注射需要量再增加30%～50%體積，注射填充過枉矯正；單點微量（0.5～1ml）、多點、多隧道（在形成隧道退針同時注射，將顆粒脂肪和干細(xì)胞“微粒”定位于受植床內(nèi)）、多平面注射，隆乳注射量為120～180ml/側(cè)，隆臀220～360ml/側(cè)，局部肌肉內(nèi)可分多層注射以保證良好血運(yùn)和盡量減少損傷；④體表局部凹陷及面部多量自體顆粒脂肪注射填充移植：可根據(jù)受區(qū)具體情況個性化處理后，多量自體顆粒脂肪注射方法同上，局部凹陷重點是采用肌肉內(nèi)分多層注射以保證良好血運(yùn)和盡量減少損傷，濕性CAL美容性豐面，重點是采用全面部深層肌肉內(nèi)多層次注射移植，注射量為100～160ml/例。因矯枉注射填充，受區(qū)術(shù)后早期有明顯腫脹，術(shù)后48h內(nèi)可間斷冰敷， 72h后可局部熱敷理療，1周內(nèi)均恢復(fù)自然；濕性CAL均采用單次注射填充移植完成， 無需重復(fù)注射移植即可達(dá)到較為滿意的治療效果；截止目前，這是含有自體新鮮ADSCs和SVF輔助多量顆粒脂肪注射填充移植操作最簡單、顆粒脂肪和干細(xì)胞“微?！睋p傷最輕、受區(qū)血運(yùn)條件最佳、安全合理的臨床標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范操作流程之一，從注射腫脹液到顆粒脂肪抽吸畢，顆粒脂肪注射填充物加工完成，注射到受區(qū)至術(shù)畢，這段規(guī)范公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程時間，在操作醫(yī)生安全可控范圍內(nèi)，操作時間越短，顆粒脂肪填充物所含脂肪細(xì)胞、ADSCs、SVF等活性越高；反之操作時間越長，細(xì)胞活性會隨時間延長而越來越低[35]。

6現(xiàn)代影像學(xué)技術(shù)在CAL中的作用

隨著現(xiàn)代影像學(xué)技術(shù)（MRI[36]、螺旋CT、多層螺旋CT血管造影、MDCTA三維重建技術(shù)[37]、最新三維掃描技術(shù)測量隆乳術(shù)后乳房體積變化術(shù)[38]）的發(fā)展，現(xiàn)今可有效、客觀、精確、測量、評定、驗證CAL術(shù)后效果及干性CAL和濕性CAL術(shù)后區(qū)別，濕性CAL術(shù)后18個月MRI成像觀察隆乳后部分個例仍顯示有脂肪組織有效增殖，乳房MRI檢查很容易分辨出壞死脂肪，發(fā)生率不足1%，術(shù)后不改變?nèi)橄俳M織結(jié)構(gòu)，不干擾乳腺成像，不影響乳腺惡性腫瘤篩查，不干擾乳腺癌診斷[39]；MRI對濕性CAL隆臀術(shù)不同注射層面顆粒脂肪移植后的壽命可進(jìn)行定量分析，同時對脂肪壞死鈣化的鑒別診斷能力明顯提高[40]。臨床上Rubin等[41]使用精確成像工具驗證干性CAL注射移植隆乳術(shù)具有較低并發(fā)癥發(fā)生率，術(shù)后6個月仍有有效組織存活，且未出現(xiàn)腫塊及其他結(jié)構(gòu)改變。

7CAL技術(shù)與受區(qū)血運(yùn)的關(guān)系

ADSCs體外培養(yǎng)過程中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞群具有穩(wěn)定的倍增效應(yīng)和低衰老性，可向多種細(xì)胞類型分化，能分泌血管內(nèi)皮生長因子等多種細(xì)胞因子[42]。李劼等[43]自人體吸脂術(shù)中脂質(zhì)部分分離培養(yǎng)ADSCs，在體內(nèi)ADSCs能夠分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞并促進(jìn)游離移植脂肪組織再血管化，提高脂肪組織存活率并減輕纖維化，ADSCs輔助顆粒脂肪移植（干性CAL）可能是一種較為理想的細(xì)胞療法。目前學(xué)者們對干性CAL和濕性CAL持有不同觀點，但為獲得預(yù)期移植效果，保證良好血運(yùn)和盡量減少損傷，卻已形成共識，因血運(yùn)不良及損傷程度均對移植效果有直接影響。自體顆粒脂肪注射移植后，血運(yùn)重建是脂肪組織再生基礎(chǔ)，脂肪細(xì)胞存活率及存活時間影響因素很多，其中最大限度減低顆粒脂肪損傷，受區(qū)盡早及時建立有效血運(yùn)循環(huán)是關(guān)鍵[44]。注射至肌內(nèi)不同層次，每層注射較少顆粒脂肪，可保證每個顆粒脂肪都有血供包圍營養(yǎng)，更易存活，現(xiàn)已逐漸成為主流顆粒脂肪注射移植方法[45]。近年許多實驗研究在移植顆粒脂肪中加入各種生長因子，以促進(jìn)移植顆粒脂肪組織內(nèi)血管增生和脂肪細(xì)胞分化[46]。ADSCs和SVF均能自身分泌血管內(nèi)皮生長因子等多種內(nèi)源性細(xì)胞生長因子，直接參與增強(qiáng)注射移植顆粒脂肪血管化過程并減低纖維化[47]。2011年，黎洪棉等[48]實驗研究結(jié)論：ADSCs與外源性血管內(nèi)皮生長因子共同參與新生脂肪組織的血管化過程，血運(yùn)重建機(jī)制是組織工程化脂肪組織成功構(gòu)建的決定性因素；血運(yùn)重建是移植脂肪組織再生基礎(chǔ)，顆粒脂肪注射移植后，盡量減少損傷和保證良好血運(yùn)是多量顆粒脂肪注射移植成活的核心因素。扁平、容積小、皮膚緊的乳房，很難容納多量顆粒脂肪，預(yù)擴(kuò)張技術(shù)采用體外擴(kuò)張器（BRAVA乳房增大系統(tǒng)輔助自體脂肪移植隆乳）可暫時增大乳房容積，彌補(bǔ)乳房空間的不足，在注射移植顆粒脂肪隆乳前即極大改善了受區(qū)血，使隆乳顆粒脂肪能獲得足夠血運(yùn)，遠(yuǎn)期美容效果明顯提高[50]。濕性CAL顆粒脂肪注射移植前，受區(qū)先局部腫脹浸潤，使各層次組織液壓膨脹和疏松無創(chuàng)分離，即在受區(qū)局部腫脹浸潤呈現(xiàn)一個“生理濕性內(nèi)環(huán)境”，使注射移植混合填充物微粒易自行彌散開，不易形成脂肪結(jié)節(jié)，又對體表軟組織凹陷及扁平小乳房等受區(qū)部位起到一定的術(shù)中即時預(yù)擴(kuò)張作用[51]。

8小結(jié)和展望

由于不同條件、不同操作者及不同受術(shù)者的不確定性因素差異，CAL效果都會有不盡相同。濕性CAL的有效性和安全性仍需大樣本臨床人體應(yīng)用進(jìn)一步遠(yuǎn)期觀察，以確定其長期安全、高效[52-53]。ADSCs和SVF臨床應(yīng)用前瞻性研究，定會創(chuàng)造整形外科新未來，也會有助于整形美容外科臨床治療方法改進(jìn)提高[54]。濕性CAL應(yīng)是現(xiàn)階段多量自體顆粒脂肪注射移植臨床醫(yī)學(xué)美容和整形治療方面的首選技術(shù)[55]，目前自體ADSCs分離、提取、培養(yǎng)技術(shù)在國際上還沒有正式開展臨床應(yīng)用，設(shè)備價格昂貴是其沒有開展的主要障礙之一。我們?nèi)孕璨粩嘌芯浚源_定CAL對顆粒脂肪注射填充移植成活率的影響機(jī)理，現(xiàn)今我國在世界CAL研究領(lǐng)域里處于領(lǐng)先水平，相信CAL技術(shù)在整形美容外科范疇具有更廣闊的應(yīng)用前景。

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[收稿日期]2012-04-28 [修回日期]2012-06-11

編輯/李陽利