單展展 王秀麗 張小虎 等

摘要：以廣西產(chǎn)天然紅輝沸石為原料制備Ａ型分子篩，采用離子交換法制備二甲酸鉀沸石抗菌劑。用Ｘ射線衍射儀（ＸＲＤ）和掃描電鏡對其進行表征分析，結(jié)果表明，Ａ型沸石分子篩成功接枝吸附了二甲酸鉀。采用菌落計數(shù)法對Ａ型沸石抗菌劑的抑菌性能進行檢測，表明最佳大腸桿菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌落計數(shù)吸光度值的范圍為０．５００～０．７００，沸石抗菌劑對大腸桿菌的抑菌率達８９．５％。

關(guān)鍵詞：沸石抗菌劑；菌落計數(shù)法；大腸桿菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）

中圖分類號：Ｓ４８２．２＋１文獻標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）15－3240-03

Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｎ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｆｅｅｄ Ｚｅｏｌｉｔｅ Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｇｅｎｔ

ＳＨＡＮ Ｚｈａｎ－ｚｈａｎａ，ＷＡＮＧ Ｘｉｕ－ｌｉａ，ＺＨＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｈｕｂ，ＣＨＥＮ Ｎａｎ－ｃｈｕｎｂ，ｃ，ＹＡＮＧ Ｚｈｅｎｇ－ｋｕｎａ，ＬＩＵ Ｆａｎｇｂ

（ａ． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Cｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Bｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ； ｂ． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ； ｃ． Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｎｏｎｆｅｒｒｏｕｓ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｇｕｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｇｕｉｌｉｎ ５４１００４， Ｇｕａｎｇｘｉ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Nａｔｕｒａｌ ｓｔｅｌｌｅｒｉｔｅ ｉｎ Ｇｕａｎｇｘｉ was used ａｓ ｒａｗ ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ｔｙｐｅ－Ａ ｚｅｏｌｉｔｅ； and ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ was applied ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｄｉｆｏｒｍａｔｅ－ｌｏａｄｅｄ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｇｅｎｔ which ｗａｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ ＸＲＤ ａｎｄ ＳＥＭ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ the ｔｙｐｅ－Ａ ｚｅｏｌｉｔｅ ｈａｄ ｇｏｏｄ ｇｒａｆｔ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｃａｐａｃｉｔｙ ｔｏ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｄｉｆｏｒｍａｔｅ．Ｔａｋｉｎｇ ｃｏｌｏｎｙ ｃｏｕｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｏｎ ｔｙｐｅ－Ａ ｚｅｏｌｉｔｅ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔ ｆｏｒ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ， tｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｃｏｌｏｎｙ ｃｏｕｎｔ ｗａｓ ０．５００～０．７００． Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｇｅｎｔ ｏｎ Ｅ． ｃｏｌｉｃｏｕｌｄ ｒｅａｃｈ ｔｏ ８９．５％．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｚｅｏｌｉｔｅ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｇｅｎｔ； ｃｏｌｏｎｙ ｃｏｕｎｔ ｍｅｔｈｏｄ； Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ

抗菌劑大體可分為有機抗菌劑和無機抗菌劑，與有機抗菌劑相比，無機抗菌劑具有高效、廣譜、持久、可加工性好、安全穩(wěn)定的特點［１，２］。沸石抗菌劑是目前最常用的無機抗菌劑之一，是通過物理吸附或離子交換等方法將抗菌劑交換到沸石上制備而成［３－７］。二甲酸鉀是一種有機酸鹽，具有無抗藥性、無殘留、無毒害等特點。其在酸性條件下穩(wěn)定，而在中性或偏堿性的條件下則分解為甲酸與甲酸鉀。二甲酸鉀添加至飼料中能有效降低動物消化道ｐＨ，抑制腸道微生物生長，從而促進畜禽生長性能和胴體的品質(zhì)［８］。但二甲酸鉀在胃中吸收較快，大都無法到達小腸，不能有效降低小腸中的酸度，無法抑制有害菌生長、促進有益菌生長。國內(nèi)外對抗菌劑的研究主要集中在載銀沸石抗菌劑上［９，１０］，然而重金屬離子易在生物體內(nèi)沉積而無法應(yīng)用于飼料。本研究以Ａ型沸石分子篩為載體制備了載二甲酸鉀的沸石抗菌劑，對其進行表征，并對其抑菌性能進行了測定。

１材料與方法

１．１Ａ型沸石分子篩及沸石抗菌劑的制備與表征

紅輝沸石粉末按液固比３∶１加入１５％ＨＣｌ溶液中，９０ ℃、２ ｈ電動攪拌，過濾，洗滌至無Ｃｌ－，烘干成酸化沸石。按照質(zhì)量比酸化沸石∶ＮａＯＨ∶ＮａＡｌＯ２∶Ｈ２Ｏ＝１∶２∶１∶４８，先將ＮａＯＨ和ＮａＡｌＯ２配制成溶液，然后依次加入到三頸瓶中，在晶化溫度９０ ℃和晶化時間６ ｈ下磁力攪拌，產(chǎn)物經(jīng)過濾、洗滌、烘干后得到Ａ型沸石分子篩。取２ ｇ Ａ型沸石分子篩加入到一定濃度的二甲酸鉀溶液２０ ｍＬ中，在一定的反應(yīng)時間、溫度、ｐＨ下進行吸附，產(chǎn)物洗滌后在６０ ℃下烘干待用。

采用荷蘭帕納科公司（ＰＡＮａｌｙｔｉｃａｌ）生產(chǎn)的Ｘｐｅｒｔ Ｐｒｏ型粉末X射線衍射儀（ＸＲＤ）對沸石原礦和Ａ型沸石分子篩進行表征，X射線發(fā)生器的最大管電壓：６０ ｋＶ，最大電流：５５ ｍＡ，２．２ｋＷ（Ｃｕ靶Ｋａ輻射，λ＝１．５４０ ６０ ｎｍ）；采用日本電子（ＪＥＯＬ）公司生產(chǎn)的掃描電子顯微鏡（ＳＥＭ）對Ａ型分子篩和Ａ型沸石抗菌劑進行表征，二次電子分辨率：３．０ ｎｍ（３０ ｋＶ，高真空模式）；放大倍數(shù)：１０～３００ ０００。

１．２Ａ型沸石抗菌劑抑菌活性測定

取大腸桿菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)１８～２４ ｈ的新鮮培養(yǎng)物，接種一環(huán)于上述營養(yǎng)液體培養(yǎng)基（不加瓊脂）中培養(yǎng)１６ ｈ，于６００ ｎｍ下測定吸光度［１１］，取１ ｍＬ菌液，用０．１％磷酸鹽緩沖液（ＰＢＳ，０．０３ ｍｏｌ／Ｌ， ｐＨ ７．２～７．４）稀釋至１０－１、１０－２、１０－３、１０－４、１０－５ 、１０－６，然后涂布計數(shù)菌落數(shù)量確定適宜濃度。 以空白培養(yǎng)基作對照，涂布菌落計數(shù)。用ＰＢＳ緩沖液稀釋菌懸液至１０６ ＣFU／ｍＬ。分別稱取沸石原礦和沸石抗菌劑粉末０．５００ ｇ放入三角燒瓶中，加入９５ ｍＬ ＰＢＳ緩沖液和５ ｍＬ預(yù)制菌懸液。固定于恒溫振蕩培養(yǎng)箱的搖床上，在３７ ℃條件下，以１５０ ｒ／ｍｉｎ速度振蕩接觸４ ｈ，后將振蕩后的樣液和對照樣液稀釋到１０－５、１０－６，吸?。担埃?μＬ于滅菌空白平皿中，每樣液平行接種兩個平皿，傾注４５～５５ ℃的瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后接種不同濃度大腸桿菌菌懸液置于３７ ℃恒溫培養(yǎng)箱中，４８ ｈ后做菌落計數(shù)， 對照樣液記作Ａ０，振蕩試樣記作Ａ４８。

２結(jié)果與分析

２．１沸石與分子篩ＸＲＤ對比分析

圖１和圖２分別為沸石原礦和Ａ型沸石分子篩的衍射圖，對比兩圖可看出兩者衍射峰值有很大的差異，表明后者結(jié)構(gòu)已發(fā)生變化，形成了新的產(chǎn)物，產(chǎn)物中Ａ型沸石強度極大，晶形完好，結(jié)晶度大。由于紅輝沸石中含有玉髓狀石英，在強酸作用下不會發(fā)生溶解，故產(chǎn)物中含有少量的石英雜晶。

２．２分子篩與抗菌劑ＳＥＭ對比分析

圖３和圖４分別為Ａ型沸石分子篩和Ａ型沸石抗菌劑的ＳＥＭ圖，前者晶粒呈立方體狀，晶形比較完整，粒度比較均勻。而后者晶粒模糊，表面有蓬松的葡萄狀顆粒，充分表明二甲酸鉀已吸附或者接枝在Ａ型沸石分子篩上。

２．３抑菌特征

對Ａ型沸石分子篩進行梯度稀釋，用涂布平板菌落計數(shù)的方法觀察各濃度梯度的菌落數(shù)，繪制出菌落數(shù)隨吸光度值變化的曲線如圖５。由圖５可看出，菌落數(shù)隨著吸光度值的增加而呈逐次遞增的線性變化，且最佳大腸桿菌菌落計數(shù)吸光度值的范圍為０．５００～０．７００。

取吸光度值為０．５００～０．７００的大腸桿菌菌液進行試驗，計算出振蕩后抗菌劑與紅輝沸石粉末對大腸桿菌的抑菌率如表１。由表１可以看出，振蕩后對照抑菌率達８．６％，小于１０．０％，表明對照樣本無明顯的抑菌作用。振蕩后Ａ型沸石抗菌劑的抑菌率達８９．５％，遠大于８．７％，表明Ａ型沸石抗菌劑的抑菌作用非常明顯，添加至飼料中可有效抑制動物體內(nèi)的大腸桿菌的生長。

３結(jié)論

本實驗主要研究了Ａ型沸石抗菌劑對大腸桿菌生長的抑制作用。探究普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中大腸桿菌的最佳生長濃度梯度，并用廣西紅輝沸石粉末作對照，采用平板計數(shù)與菌液混合培養(yǎng)法，考察對大腸桿菌生長的抑制作用，結(jié)論如下：

１）通過ＸＲＤ和ＳＥＭ的對比分析可知，Ａ型沸石分子篩已成功吸附二甲酸鉀。

２）最佳大腸桿菌菌落計數(shù)吸光度值的范圍為０．５００～０．７００，較適合的濃度梯度為１０－５與１０－６，各生長菌落數(shù)的數(shù)量級為１０６ ＣFU／ｍＬ。

３）Ａ型沸石抗菌劑與廣西紅輝沸石粉末對大腸桿菌的生長均有不同程度的抑制效果，Ａ型沸石抗菌劑的效果更加明顯。振蕩后Ａ型沸石抗菌劑的抑菌率達８９．５％，從而有效抑制腸道有害菌，維持和改善腸道微生態(tài)平衡。沸石原礦也有一定的抑菌作用，這是因為其內(nèi)部結(jié)構(gòu)中含有銀元素的緣故。

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