王師平　郭樹(shù)忠

組織工程是應(yīng)用生命科學(xué)和工程學(xué)原理，研究開(kāi)發(fā)能夠修復(fù)、維持或改善組織損傷能力的生物替代物的一門(mén)學(xué)科[1]。利用組織工程方法再造軟骨，為臨床上軟骨缺損的修復(fù)帶來(lái)了新的途徑，種子細(xì)胞作為軟骨組織工程學(xué)研究的首要方面，它的來(lái)源途徑也就尤為重要。目前的組織工程軟骨種子細(xì)胞的來(lái)源主要為自體軟骨細(xì)胞、同種異體軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、干細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞等，成熟軟骨細(xì)胞是最常被關(guān)注的種子細(xì)胞，人們已經(jīng)深入研究了其產(chǎn)生、維持和改造軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的作用；成纖維細(xì)胞來(lái)源廣泛，并能誘導(dǎo)其直接向軟骨轉(zhuǎn)化[2]；干細(xì)胞的研究則成為近期的熱點(diǎn)，它不但有多向分化潛能并可來(lái)源于多種組織，這類細(xì)胞可在維持其分化潛能的前提下通過(guò)多種途徑擴(kuò)增，此外干細(xì)胞還能通過(guò)基因?qū)W上的改變來(lái)誘導(dǎo)或增強(qiáng)軟骨化過(guò)程。目前的研究目標(biāo)就是找到一種能被簡(jiǎn)單分離出來(lái)，具有擴(kuò)增能力并能在培養(yǎng)過(guò)程中表達(dá)和合成軟骨特異成分（如Ⅱ型膠原和糖胺多糖）的理想種子細(xì)胞[3]。

1各種成熟軟骨細(xì)胞

自體軟骨細(xì)胞是當(dāng)前組織工程研究中最常用的種子細(xì)胞來(lái)源。目前，許多研究?jī)A向于使用關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞作為軟骨修復(fù)的可行性細(xì)胞來(lái)源，但是獲取關(guān)節(jié)軟骨是有創(chuàng)的并且潛在供區(qū)并發(fā)癥和功能損傷。此外，細(xì)胞收獲率低、分裂速度慢和生物活性低等缺陷都進(jìn)一步限制了關(guān)節(jié)軟骨的臨床應(yīng)用。由于以上限制，研究者已著手尋找其他自體軟骨細(xì)胞來(lái)源，這包括耳軟骨、鼻軟骨和肋軟骨等。由于這些自體軟骨在部位、功能和組成上的不同而造成它們?cè)诩?xì)胞外基質(zhì)的生成、生化、物理性質(zhì)和生物力學(xué)方面的差異，因此，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況具體選擇使用[3]。

彈性軟骨包括形成耳的耳廓軟骨和會(huì)厭軟骨，Van Osch等[4]提出人類耳廓軟骨有應(yīng)用于軟骨修復(fù)的潛力。與關(guān)節(jié)軟骨相比，耳廓軟骨的細(xì)胞獲取量可提高20%并且其細(xì)胞增殖速度較前者快4倍；體內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，通過(guò)特殊染色觀察到它可形成富含蛋白多糖的基質(zhì)；此外，在體內(nèi)培養(yǎng)時(shí)耳廓軟骨與關(guān)節(jié)軟骨相比，前者在生物化學(xué)和組織學(xué)上與未成熟軟骨有更高的相似性[5-7]。鼻軟骨是一種透明軟骨，它在顱頜面外科與整形外科得到了廣泛的應(yīng)用。成體鼻軟骨能生成較多的Ⅰ/Ⅱ型膠原并能蓄積GAG[8]。此外，鼻軟骨在單層培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞增殖速度較關(guān)節(jié)軟骨快4倍[8]，并能低密度種植培養(yǎng)且不會(huì)發(fā)生去分化作用[9]。同時(shí)，在不同的載體和支架上，鼻軟骨細(xì)胞已被成功地培養(yǎng)成多細(xì)胞大顆粒聚集體[10-11]。其他研究還表明在去血清培養(yǎng)時(shí)，鼻軟骨細(xì)胞能對(duì)TGF-β1、FGF-2、BMP-2和IGF-1[12]等生長(zhǎng)因子應(yīng)答，同時(shí)其增殖速度和基質(zhì)沉積量也有所提高。

在一項(xiàng)軟骨細(xì)胞來(lái)源的對(duì)照研究中，研究者把牛鼻軟骨、肋軟骨和耳軟骨細(xì)胞置于多聚合物支架上生長(zhǎng)4周[13]，不同軟骨細(xì)胞的增殖率和基因表達(dá)情況各不相同，其中Ⅱ型膠原和蛋白聚糖表達(dá)量最高的是肋軟骨細(xì)胞，然后是鼻軟骨、關(guān)節(jié)軟骨和耳軟骨細(xì)胞；同時(shí)不同細(xì)胞增殖后構(gòu)成的形狀也有差別，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖后直徑最大而肋軟骨細(xì)胞形成結(jié)構(gòu)則最厚。另一項(xiàng)研究關(guān)注生長(zhǎng)因子對(duì)以上各軟骨細(xì)胞的作用，其具體作用表現(xiàn)為可加快細(xì)胞增殖速度、提高GAG/DNA含量和增量調(diào)節(jié)Ⅱ型膠原的表達(dá)；然而再分化現(xiàn)象僅發(fā)生于耳廓軟骨和鼻軟骨細(xì)胞增殖過(guò)程中[14]。此外，Johnson等[15]指出在活體內(nèi)，關(guān)節(jié)、耳和肋軟骨細(xì)胞在纖維蛋白膠軟骨合成物上培養(yǎng)時(shí)，可形成新的軟骨基質(zhì)。

2成纖維細(xì)胞

成纖維細(xì)胞容易培養(yǎng)，且擴(kuò)增性極好，對(duì)組織工程學(xué)來(lái)說(shuō)，成纖維細(xì)胞不但來(lái)源充足，并且從皮膚取材其創(chuàng)傷較小。雖然將成纖維細(xì)胞直接植入軟骨缺損區(qū)會(huì)導(dǎo)致纖維組織生成[16]，可是在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下，成纖維細(xì)胞可重新向軟骨組織分化。經(jīng)IGF-1預(yù)先處理的人皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于蛋白多糖樣聚合物上，其GAGs和Ⅱ型膠原染色呈陽(yáng)性[17]；此外，當(dāng)培養(yǎng)于去礦物質(zhì)骨[18]或生長(zhǎng)于乳酸[4]環(huán)境中，皮膚成纖維細(xì)胞可表達(dá)軟骨特異性的基質(zhì)蛋白，如蛋白聚糖和Ⅱ型膠原。同時(shí)，成纖維細(xì)胞可表達(dá)TGF-β，將其注射入軟骨缺損處，在6周后可觀察到有新生透明軟骨生成[19]。最近，Deng等[20]分離出一種皮膚來(lái)源的細(xì)胞亞群，這種細(xì)胞命名為“真皮來(lái)源蛋白多糖敏感細(xì)胞（DIAS）”。此外，DIAS細(xì)胞的立體自我分化增殖可形成豐富的軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)。

3干細(xì)胞

近來(lái)，干細(xì)胞作為自身軟骨種子細(xì)胞來(lái)源的又一選擇，引起了組織工程界的廣泛關(guān)注。1998年，研究者發(fā)現(xiàn)骨髓干細(xì)胞在有TGF-β1存在下以細(xì)胞團(tuán)塊的方式培養(yǎng)時(shí)可有軟骨形成[21]。之后，脂肪組織被發(fā)現(xiàn)也可作為一種干細(xì)胞來(lái)源，并且它可通過(guò)簡(jiǎn)單的局麻手術(shù)即可分離獲得[22]，此外，研究用于軟骨修復(fù)的干細(xì)胞還可來(lái)源于肌肉[23]、滑膜[24]和骨膜[25]等。

3.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）：骨髓中只含有少量間充質(zhì)干細(xì)胞，僅占骨髓細(xì)胞的0.01/萬(wàn)～1.00/萬(wàn)，并隨年齡的增加而減少。體外單層培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞外形類似成纖維細(xì)胞，呈長(zhǎng)梭形且體積較大。原代細(xì)胞接種貼壁后可形成2～4個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，經(jīng)過(guò)2～4天的潛伏期后開(kāi)始迅速地克隆性擴(kuò)增，類似漩渦狀盤(pán)旋排布，經(jīng)傳代的細(xì)胞形態(tài)更趨一致，對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期細(xì)胞倍增時(shí)間為33～38h。具有強(qiáng)大的增殖擴(kuò)增能力是BMSCs一個(gè)重要的生物學(xué)特征，其可穩(wěn)定傳至20～25代而不改變細(xì)胞性狀，Conget等[26]檢測(cè)人BMSCs中約有20%的細(xì)胞處于靜止期（G0期），此比例足以維持增殖分化所需的細(xì)胞供給。Colter等[27]報(bào)道極低密度培養(yǎng)能保持BMSCs的增殖力，20ml的骨髓樣本經(jīng)3代6周的培養(yǎng)可擴(kuò)增2×109倍，達(dá)1013個(gè)細(xì)胞，相當(dāng)于成年人體細(xì)胞總數(shù)。具有多向分化的潛能是BMSCs最重要的生物學(xué)特征，近年來(lái)已被大量研究所證實(shí)。在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下BMSCs不僅可以分化為間充質(zhì)組織，還保持有內(nèi)外胚層的組織發(fā)育分化潛能，可以分化為神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、肺臟、上皮組織等。Friedenstein首先證實(shí)了BMSCs具有分化為骨、軟骨、纖維組織的能力。有學(xué)者在單層培養(yǎng)條件下大量擴(kuò)增BMSCs，也有學(xué)者在單層培養(yǎng)下對(duì)BMSCs 進(jìn)行定向分化誘導(dǎo)。Worster等[28]對(duì)來(lái)源于馬的BMSCs定向誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞，檢測(cè)到軟骨細(xì)胞特征標(biāo)識(shí)物及觀察到具有軟骨細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞，但未觀測(cè)到軟骨樣組織形成。Yoo等[29]對(duì)體外單層或聚集立體培養(yǎng)下的成人BMSCs進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在其他條件相同時(shí)，立體培養(yǎng)的BMSCs發(fā)生了定向軟骨分化，而單層培養(yǎng)則無(wú)軟骨形成。Liechty等[30]將人BMSCs移植入早期妊娠的胎羊，異種的細(xì)胞入住多種組織存活達(dá)13 個(gè)月，并按接種部位特異性地分化為軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞，說(shuō)明BMSCs不僅保持了多分化潛能且具有獨(dú)特的免疫學(xué)特性。

3.2 脂肪干細(xì)胞：脂肪組織中可分離出外形類似成纖維細(xì)胞樣的脂肪干細(xì)胞，其在體外培養(yǎng)時(shí)有穩(wěn)定的增殖速度且不易老化。經(jīng)免疫熒光法和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析確定，這些細(xì)胞起源于間充質(zhì)細(xì)胞，它們?cè)赥GF-β、維生素C和地塞米松存在并通過(guò)立體培養(yǎng)可向軟骨細(xì)胞分化 [31]。高濃度微塊培養(yǎng)[32]或?qū)⑵浣臃N在藻酸鹽[33-34]、瓊脂糖[33]和膠原支架[33，35]時(shí)分化可以實(shí)現(xiàn)。體外培養(yǎng)時(shí)，成軟骨誘導(dǎo)的脂肪衍生干細(xì)胞（ADSCs）可產(chǎn)生軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)，并且存在均一的張力和剪切模量以及硫酸化的GAGs沉積[33]。Masuoka等證實(shí)，將ADSCs接種于Ⅰ型膠原構(gòu)成的蜂窩狀支架，在兔身上構(gòu)建的透明軟骨可修復(fù)全層軟骨缺損[35]。此外，一種新的彈力膠原樣多肽已被證明能在無(wú)培養(yǎng)基的情況下促進(jìn)ADSCs向軟骨分化[36]，培養(yǎng)兩周后其聚集的硫酸化GAGs和Ⅱ型膠原量與在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基培養(yǎng)的情況類似。

3.3 胚胎干細(xì)胞：胚胎干細(xì)胞來(lái)源于植入子宮前的胚胎，可來(lái)自早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或尿生殖嵴， 是一種可在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)并保持高度分化潛能的細(xì)胞。目前，人胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞系己成功建立。胚胎干細(xì)胞是全能干細(xì)胞， 可分化為三個(gè)胚層所有類型的細(xì)胞， 種植于體內(nèi)可形成包含三胚層細(xì)胞的畸胎瘤。改變體外培養(yǎng)條件， 可使胚胎干細(xì)胞向不同的細(xì)胞系分化。己有文獻(xiàn)報(bào)道胚胎干細(xì)胞在BMP-2和BMP-4的作用下分化為軟骨細(xì)胞[37]。但使用胚胎干細(xì)胞作為組織工程的種子細(xì)胞主要是存在倫理學(xué)問(wèn)題， 此外， 如何控制干細(xì)胞向特定類型細(xì)胞分化，分化后的種子細(xì)胞在宿主體內(nèi)是否具有致瘤性等問(wèn)題仍值得深入研究。在軟骨組織工程的潛在種子細(xì)胞中， 干細(xì)胞與已分化的成熟軟骨細(xì)胞相比， 除具有更強(qiáng)的增殖能力外， 還具有再生潛能， 可維持整個(gè)生命過(guò)程中細(xì)胞的更新和正常功能， 因而干細(xì)胞作為種子細(xì)胞可能更具優(yōu)勢(shì)。

4轉(zhuǎn)基因細(xì)胞

細(xì)胞的生長(zhǎng)、定向分化和活性維持均需生長(zhǎng)因子的調(diào)控。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將生長(zhǎng)因子基因轉(zhuǎn)入種子細(xì)胞， 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可在缺損局部持續(xù)表達(dá)高生物活性的內(nèi)源性生長(zhǎng)因子， 調(diào)控其自身增殖分化， 延緩體外培養(yǎng)種子細(xì)胞的老化及去分化， 同時(shí)促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、分化， 提高修復(fù)質(zhì)量。Mason等[38]首先報(bào)道用基因治療和組織工程法結(jié)合修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨。以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體把BMP27脫氧核糖核酸導(dǎo)入兔骨髓干細(xì)胞，種植至PGA支架培養(yǎng)后，移植至兔關(guān)節(jié)軟骨損傷模型，8～12 周軟骨基本修復(fù)。Davidson等[39]用FGF218通過(guò)其受體3促進(jìn)了軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)?；蜣D(zhuǎn)染可以用來(lái)調(diào)控軟骨種子細(xì)胞增殖和維持其表型， 軟骨細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞均可作基因治療的受體細(xì)胞。通過(guò)體外軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染基因， 既可對(duì)軟骨基質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白的突變起到補(bǔ)償，還可以釋放細(xì)胞因子增加基質(zhì)的合成， 促進(jìn)軟骨的修復(fù)， 又可對(duì)抗局部炎癥的發(fā)生。將具有免疫抑制作用的基因轉(zhuǎn)入種子細(xì)胞可克服同種異體甚至異種細(xì)胞的免疫原性， 大大地拓展了軟骨組織工程種子細(xì)胞的范圍。

5展望

目前， 雖然對(duì)何種來(lái)源的細(xì)胞作為軟骨組織工程的首選種子細(xì)胞仍有爭(zhēng)議， 軟骨組織工程種子細(xì)胞的許多問(wèn)題尚待解決，如：種子細(xì)胞的改造、種子細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增技術(shù)的完善，如何延長(zhǎng)細(xì)胞的壽命、降低細(xì)胞抗原性及增強(qiáng)宿主免疫耐受等。但目前一般認(rèn)為， 隨著體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的成熟， 大家公認(rèn)的體外培養(yǎng)的自體細(xì)胞已經(jīng)運(yùn)用于臨床， 且發(fā)揮了一定的作用。人胚胎干細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞具有巨大的應(yīng)用前景， 已開(kāi)始逐漸成為軟骨組織工程學(xué)研究的熱點(diǎn)。

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[收稿日期]2012-05-28[修回日期]2012-07-13

編輯/李陽(yáng)利