楊正坤　王秀麗　龍施華　郝再彬　單展展　周菲菲

摘要：應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)染色法測定大豆莖葉中蛋白質(zhì)含量。結(jié)果表明，該法測定大豆莖葉中蛋白質(zhì)含量是可行的，其RSD為0.25%～1.27%，回收率為94.9%～106.4%，大豆莖葉蛋白質(zhì)平均含量為7.673%和11.315%。該方法簡便快速，靈敏度高、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確率相對較高，可用于微量可溶性蛋白質(zhì)含量的測定。

關(guān)鍵詞：大豆莖葉；蛋白質(zhì)含量；考馬斯亮藍(lán)染色法

中圖分類號：TS63文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：0439-8114（2012）20-4610-03

蛋白質(zhì)是一項(xiàng)質(zhì)量和資源評價(jià)的重要指標(biāo)[1]，用一種快速、準(zhǔn)確、方便的方法來檢測蛋白質(zhì)含量是必不可少的。近年來，許多學(xué)者用考馬斯亮藍(lán)染色法和其他方法對蛋白質(zhì)含量進(jìn)行了測定[2-9]。蛋白質(zhì)中的酰胺基團(tuán)與考馬斯亮藍(lán)染料中的陰離子結(jié)合使溶液顯藍(lán)色，測定效果可通過測定顯色穩(wěn)定性等多個(gè)性狀指標(biāo)進(jìn)行全面客觀地評價(jià)。本試驗(yàn)采用盆栽大豆，對大豆的莖葉蛋白質(zhì)含量與大豆產(chǎn)量進(jìn)行考察，通過分析它們之間的影響與關(guān)系，為今后大豆育種工作提供試驗(yàn)方法。

1材料與方法

1.1材料

供試樣品為大豆莖葉（實(shí)驗(yàn)室自制）。

牛血清白蛋白（進(jìn)口分裝），購于上海億欣生物科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250（進(jìn)口分裝），購于中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2儀器

SHB-IIIS循環(huán)水式多用真空泵和抽濾裝置（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）、EL303型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；Cary50紫外分光光度計(jì)（美國瓦里安有限公司）。

1.3方法

1.3.1蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取牛血清白蛋白100.0 mg，用去離子水定容至100 mL，即為

1 mg/mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液，4 ℃保存待用。

1.3.2考馬斯亮藍(lán)G-250溶液的制備稱取考馬斯亮藍(lán)G-250 100.0 mg于研缽中，取體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇（下同）50 mL，從中取約10 mL加入研缽，將考馬斯亮藍(lán)G-250研成粉并溶解；輕輕將上層液體轉(zhuǎn)入500 mL燒杯中，再取10 mL乙醇溶液于研缽中研磨，同法收集，重復(fù)洗滌3次。最后用20 mL乙醇分次洗滌研缽，合并液體于燒杯中。取體積分?jǐn)?shù)為85%濃磷酸100 mL分次加入燒杯再轉(zhuǎn)入

1 L容量瓶，定容，抽濾，得考馬斯亮藍(lán)G-250溶液。

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別吸取0.2～1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液于10 mL試管中，各管補(bǔ)加0.15 mol/L NaCl溶液至1 mL，各取0.1 mL于新試管中并加入5 mL考馬斯亮藍(lán) G-250溶液，搖勻，放置 2 min，于595 nm 處測定其吸光度[7]。

1.3.4樣品中蛋白質(zhì)含量的測定取樣品溶液0.1 mL，按上述方法測定其吸光度，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出樣品的蛋白質(zhì)含量[8]。

2結(jié)果

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的建立

用紫外分光光度計(jì)，以0.15 mol/L的NaCl溶液作空白對照，在595 nm處測定對照品溶液吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，蛋白濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

通過測定不同濃度牛血清白蛋白的吸光度得其線性回歸方程式：Y=0.478 3X+0.070 3，R2=0.999 3。

2.2樣品蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果

按蛋白質(zhì)含量測定方法，同時(shí)做3個(gè)重復(fù)，大豆莖的吸光度為0.434 2、0.440 2和0.437 5 a.u.，大豆葉的吸光度為0.611 4、0.611 0和0.612 1 a.u.。計(jì)算大豆莖的蛋白質(zhì)含量為7.608%、7.734%和7.677%，平均含量為7.673%；大豆葉的蛋白質(zhì)含量為11.313%、11.305%和11.328%，平均含量為11.315%。

2.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

量取同一樣品溶液 1 mL，每隔 10 min 測定1次，觀測其穩(wěn)定性，結(jié)果見表1，表明在顯色1 h 內(nèi)吸光度穩(wěn)定，RSD分別為0.04%和0.39%。

2.4重復(fù)性試驗(yàn)

按上述方法，分別測定大豆莖和葉蛋白提取液的吸光度，檢驗(yàn)該方法的重現(xiàn)性，結(jié)果見表2，RSD分別為0.83%和1.27%，小于5%，表明重現(xiàn)性較好。

2.5精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取牛血清白蛋白溶液（1 mg/mL）0.5 mL進(jìn)行精密度試驗(yàn)，連續(xù)測定其吸光度6次，其RSD為0.25%，小于5%，表明精密度較好，結(jié)果見表3。

2.6回收率測定

取已配制好的1 mg/mL牛血清白蛋白溶液0.1 mL，加入1 mL大豆莖（或葉）樣品溶液，然后再加入5 mL考馬斯亮藍(lán)染色液，搖勻，靜置2 min左右，于595 nm處測定其吸光度，以不加牛血清白蛋白溶液作為空白對照，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出相應(yīng)濃度，然后計(jì)算加入樣品蛋白的量，并計(jì)算回收率[9]，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度較高，可滿足大豆莖葉中蛋白含量的快速定量分析。

3討論

蛋白質(zhì)分子均具有酰胺基團(tuán)，棕紅色的考馬斯亮藍(lán)G-250染料上的陰離子與蛋白質(zhì)的酰胺基團(tuán)結(jié)合，使溶液變?yōu)樗{(lán)色，由于溶液在595 nm處吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，因此595 nm處測定吸光度，可計(jì)算出樣品中蛋白質(zhì)含量[6]。上述結(jié)果表明，考馬斯亮藍(lán)與蛋白質(zhì)中的酰胺基團(tuán)結(jié)合生成的藍(lán)色非常穩(wěn)定，在1 h之內(nèi)吸光度值變化很小，重復(fù)性較好，精密度較高，同時(shí)該方法測定蛋白含量的回收率符合大豆莖葉蛋白質(zhì)含量的測定要求。大豆莖蛋白質(zhì)提取液中蛋白質(zhì)含量在0.7～1.0 mg/mL范圍內(nèi)；大豆葉蛋白質(zhì)提取液中蛋白質(zhì)含量在1.1～2.0 mg/mL范圍內(nèi)，用考馬斯亮藍(lán)染色法測定大豆莖葉蛋白質(zhì)的含量優(yōu)于其他傳統(tǒng)方法[10，11]。但另一方面，該法線性范圍窄，低濃度樣品易受影響，因此，在測定時(shí)所用試管須經(jīng)酸浸泡，洗凈后應(yīng)經(jīng)高溫烘干。當(dāng)樣品濃度大于一定濃度時(shí)，須稀釋測定，另外，可用乙醇和去離子水清洗比色皿上粘染的色素[12]。綜上所述，該法準(zhǔn)確率較高且簡便靈敏，對設(shè)備要求低，受干擾小，適宜于測定大豆莖葉的蛋白質(zhì)含量。

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