褚秀玲　段玉梅　曲緒友　李俊霞　蘇建青

摘要：采用細(xì)胞培養(yǎng)法對(duì)疑似犬細(xì)小病毒的糞便和內(nèi)臟進(jìn)行了分離和鑒定，并對(duì)分離到的病毒進(jìn)行生物學(xué)特性鑒定和動(dòng)物回歸試驗(yàn)。結(jié)果共分離到3株CPV，分離株在貓腎細(xì)胞F81產(chǎn)生明顯細(xì)胞病變，血凝效價(jià)達(dá)1∶27～1∶210，細(xì)胞病變能被犬細(xì)小病毒陽(yáng)性血清所抑制，接種幼犬后，分離株3可以引起試驗(yàn)犬發(fā)病死亡。

關(guān)鍵詞：犬細(xì)小病毒；分離；鑒定

中圖分類號(hào)：S852.65+9.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：0439-8114（2012）20-4576-03

犬細(xì)小病毒（Canine parvovirus，CPV）屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬，為單股、負(fù)義、線形無(wú)囊膜的DNA病毒[1]。CPV可引起犬的出血性腸胃炎和心肌炎，并使白細(xì)胞大量減少，在幼犬中的發(fā)病率和死亡率都很高[2]。CPV對(duì)多種理化因素和常用消毒劑具有較強(qiáng)的抵抗力，在4～10 ℃存活6個(gè)月，37 ℃存活2周，56 ℃存活24 h，80 ℃存活15 min，在糞便中可存活數(shù)月至數(shù)年[3]；該病毒對(duì)乙醚，氯仿和醇類有抵抗力[4]。CPV一年四季均可發(fā)病，以冬、春多發(fā)[5]，飼養(yǎng)管理?xiàng)l件驟變、長(zhǎng)途運(yùn)輸、寒冷、擁擠均可促使該病發(fā)生[6]。病犬是主要傳染源，其嘔吐物、唾液、糞便中均有大量病毒[7]。根據(jù)臨床癥狀和血清學(xué)反應(yīng)，可做出準(zhǔn)確診斷[8-13]。本研究通過(guò)對(duì)山東毒株分離，并對(duì)其部分生物學(xué)特性進(jìn)行研究，為該病的防治和后續(xù)研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑DMEM培養(yǎng)基為Gibco產(chǎn)品；小牛血清、谷氨酸胺、雙抗、胰蛋白酶等購(gòu)自大連寶生物TaKaRa有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純?cè)噭?/p>

1.1.2病料病料為2009～2011年聊城大學(xué)獸醫(yī)院收集或其他養(yǎng)犬場(chǎng)送檢的可疑CPV病料，包括20份糞便樣品和10份臟器。

1.1.3試驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞8只40～50日齡的山東細(xì)犬幼犬（抗CPV HI抗體效價(jià)小于1∶4），健康狀況良好；貓腎傳代細(xì)胞系（F81）和犬腎傳代細(xì)胞系（MDCK）等由聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2方法

1.2.1試劑的配制

1）1%豬紅細(xì)胞懸液的制備。用20 mL注射器內(nèi)吸入阿氏液3～5 mL，于健康豬前腔靜脈采血10～15 mL，立即混勻，4 ℃保存?zhèn)溆?。使用時(shí)用PBS洗滌保存的豬紅細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，洗滌3次，取紅細(xì)胞泥1 mL加稀釋液100 mL，再加入小牛血清白蛋白0.1 g，即為1%豬紅細(xì)胞懸液。

2）HA抗原配制。用移液器向V型血凝板每孔加稀釋液25 μL，然后吸取25 μL經(jīng)福爾馬林滅活的CPV細(xì)胞培養(yǎng)物，在血凝板上倍比稀釋，最后1孔不稀釋，作為陰性對(duì)照；接著每孔加稀釋液25 μL和1%豬紅細(xì)胞懸液50 μL，于振蕩器上振蕩1 min混勻，于4 ℃冰箱靜置1～2 h，待紅細(xì)胞完全沉淀后判定。判定的方法是以50%紅細(xì)胞凝集為終點(diǎn)，在對(duì)照孔紅細(xì)胞完全不凝集，呈圓形小點(diǎn)沉于孔底時(shí)，凝集終點(diǎn)的稀釋倍數(shù)即為該抗原的HA效價(jià)，將此效價(jià)除以8，即是8單位血凝抗原的稀釋倍數(shù)。

1.2.2病料的處理

1）糞便樣品的處理：將病犬糞便用DMEM培養(yǎng)液稀釋（m∶m=1∶9），再加等量的氯仿混勻，4 000 r/min離心10 min，取上清，加入雙抗200 μL，4 ℃過(guò)夜，再經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2）臟器樣品的處理。將臟器樣品用滅菌后的研磨器進(jìn)行研磨，并反復(fù)凍融3次，同時(shí)加入9倍體積的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，5 000 r/min離心25 min，取上清液，經(jīng)過(guò)濾除菌。將處理好的樣品置-20 ℃保存，待分離鑒定。

1.2.3血清樣品HI抗體效價(jià)的測(cè)定取待檢血清0.2 mL，加入豬紅細(xì)胞懸液1滴，混勻于室溫吸收1 h，離心取上清液待檢。先用移液器向血凝板每孔加稀釋液25 μL，然后吸取待檢血清25 μL，在血凝板上倍比稀釋，最后2孔不稀釋作為對(duì)照，每孔加8單位HA抗原25 μL，最后1孔不加，作為血清對(duì)照。加完后振蕩混勻，于4 ℃冰箱靜置1～2 h判定。判定的方法是以完全不凝集為終點(diǎn)，在抗原對(duì)照孔完全凝集，血清對(duì)照孔完全不凝集的情況下，血清出現(xiàn)終點(diǎn)抑制的稀釋倍數(shù)，即為該血清的HI效價(jià)。

1.2.4病毒的分離采用同步接毒法，在F81細(xì)胞消化傳代后，按培養(yǎng)液量體積的1/10接入處理過(guò)的樣品，37 ℃靜置培養(yǎng)3～5 d，每天觀察有無(wú)細(xì)胞病變。如無(wú)細(xì)胞病變，則于培養(yǎng)的第4～5 d收取上清，繼續(xù)按常規(guī)傳代培養(yǎng)，至第5代仍無(wú)病變判為分離結(jié)果陰性；若出現(xiàn)細(xì)胞病變則分離結(jié)果為陽(yáng)性，反復(fù)凍融3次，收毒，-20 ℃保存。

1.2.5生物學(xué)特性鑒定

1）理化特性。按《動(dòng)物病毒學(xué)》[3]規(guī)定進(jìn)行，取分離病毒的F81細(xì)胞培養(yǎng)物，分別做以下處理：50 ℃水浴作用60 min；加20%乙醚振蕩10 min，放4 ℃過(guò)夜，并無(wú)菌揮發(fā)除去全部乙醚；將病毒液調(diào)節(jié)pH為3時(shí)于4 ℃作用處理1 h，再用0.1 mol/L NaOH調(diào)至pH 7.2，進(jìn)行耐酸性試驗(yàn)，然后分別用F81細(xì)胞測(cè)定其TCID50變化。

2）紅細(xì)胞血凝試驗(yàn)。采用微量血凝（HA）試驗(yàn)，分別用0.5%的雞、豬、大鼠、兔和人（O型）的紅細(xì)胞懸液測(cè)定病毒培養(yǎng)液的HA效價(jià)。

3）細(xì)胞敏感譜。選用貓腎傳代細(xì)胞系（F81）、犬腎傳代細(xì)胞系（MDCK）作為接種對(duì)象，分別分離得到HA效價(jià)≥1∶128的細(xì)胞培養(yǎng)液。按常規(guī)方法進(jìn)行同步接毒，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，換液，每天觀察細(xì)胞病變（CPE），4～5 d收獲凍融，再以同樣方法連傳5代，以出現(xiàn)CPE作為感染指標(biāo)。

1.2.6動(dòng)物回歸試驗(yàn)

用所分離的CPV分離株1，2和3（HA效價(jià)均為1∶512～1∶2 048）對(duì)試驗(yàn)犬進(jìn)行人工感染試驗(yàn)。接種途徑為口服，劑量為5 mL，設(shè)空白對(duì)照組和試驗(yàn)組。將幼犬隨機(jī)分為4組，每組2只。試驗(yàn)Ⅰ組幼犬接種分離株1；試驗(yàn)Ⅱ組幼犬接種分離株2；試驗(yàn)Ⅲ組幼犬接種分離株3；將第4組設(shè)為空白對(duì)照，接種生理鹽水。對(duì)4組試驗(yàn)犬進(jìn)行隔離飼養(yǎng)。接種后，每天觀察試驗(yàn)犬的臨床變化并進(jìn)行體溫的測(cè)量，每3 d進(jìn)行一次白細(xì)胞計(jì)數(shù)，自接種后5 d開始收集糞便，并進(jìn)行CPV的HA/HI檢測(cè)。攻毒后觀察15 d，如無(wú)眼觀臨床癥狀、白細(xì)胞總數(shù)正常，則視為試驗(yàn)犬健康。

2結(jié)果與分析

2.1病毒分離結(jié)果

將處理后的病料接種F81細(xì)胞后，采用同步接毒進(jìn)行病毒分離。在第一代細(xì)胞病變不明顯，但盲傳至第3～5代時(shí)，部分接毒細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞圓縮、拉網(wǎng)和脫落等細(xì)胞病變，而對(duì)照細(xì)胞排列緊密，生長(zhǎng)旺盛，呈不規(guī)則形（見圖1～2）。試驗(yàn)共從3份病料中分離出病毒，分別命名為CPV分離株1、分離株2和分離株3。

2.2生物學(xué)特性

1）理化特性。經(jīng)50 ℃、20%乙醚和酸（pH 3.0）處理后，通過(guò)比較處理前后TCID50的變化發(fā)現(xiàn)TCID50效價(jià)相差都小于2個(gè)數(shù)量級(jí)，變化不大。說(shuō)明分離毒株能抵抗乙醚、酸（pH 3.0）和熱（50 ℃），這與細(xì)小病毒理化特性一致。

2）紅細(xì)胞血凝結(jié)果。采用微量血凝試驗(yàn)測(cè)定各病毒分離株對(duì)雞、豬、大鼠、兔和人紅細(xì)胞的HA效價(jià)。分離株對(duì)豬紅細(xì)胞的凝集效價(jià)達(dá)到1∶27～1∶210；而對(duì)其他紅細(xì)胞的血凝效價(jià)為20，沒有血凝性。與文獻(xiàn)記載的CPV血凝譜相符。

3）細(xì)胞感染譜。將CPV分離株在多種細(xì)胞上同步接毒培養(yǎng)5代，并每天觀察CPE。結(jié)果表明，有3株CPV分離株連續(xù)傳代后出現(xiàn)細(xì)胞病變現(xiàn)象，分別命名為分離株1、2、3。

2.3動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果

用病毒分離株感染幼犬后第5～6天，試驗(yàn)組均發(fā)病。其中試驗(yàn)Ⅲ組即接種CPV分離株3的2只幼犬在接種后第5天開始出現(xiàn)臨床癥狀，精神沉郁，嘔吐，排稀糞。隨后轉(zhuǎn)為拉血、脫水、食欲廢絕，最后死亡。

對(duì)病死幼犬病理剖檢發(fā)現(xiàn)空腸和回腸局部充血、粘膜脫落，腸系膜淋巴結(jié)腫脹，腸腔內(nèi)有血樣糞便。其他2組試驗(yàn)組犬接種后第6天表現(xiàn)出精神沉郁，體溫增高，食欲下降，拉稀便，但后來(lái)自行康復(fù)。所有接毒試驗(yàn)犬的白細(xì)胞總數(shù)均出現(xiàn)不同程度的下降。但對(duì)照犬的白細(xì)胞總數(shù)沒有明顯變化。

試驗(yàn)組犬在攻毒后5～8 d，幼犬糞便的HA效價(jià)為1∶128～1∶512，對(duì)照犬的糞便HA檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

3討論

3.1病毒分離

本試驗(yàn)通過(guò)采集疑似CPV感染犬的糞便和內(nèi)臟，經(jīng)處理后接種于貓腎細(xì)胞分離病毒，然后通過(guò)對(duì)分離病毒的生物學(xué)特性、血凝抑制試驗(yàn)和動(dòng)物回歸試驗(yàn)等方法對(duì)病毒株進(jìn)行了鑒定。

CPV無(wú)囊膜，用氯仿處理糞便可使有囊膜的病毒失活，有利于該病毒的分離和純化。部分出血很明顯的細(xì)小病毒樣本，反而沒有分離出病毒?？赡芤?yàn)樵诩膊≈泻笃?，由于腸道出血，血液中的犬細(xì)小病毒抗體和細(xì)小病毒形成抗原抗體復(fù)合物，造成樣品中的病毒量減少，細(xì)胞分離呈陰性。糞便中毒素和組織分解代謝產(chǎn)物會(huì)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生一定的影響。因此，如何處理糞便，盡量減少對(duì)細(xì)胞的毒性，成為能否成功分離病毒的關(guān)鍵。可以減少接種樣本數(shù)量（1/20～1/30），或接種后及時(shí)換液，可有效降低糞便中毒素對(duì)細(xì)胞的毒害作用，提高病毒分離率。CPV的復(fù)制須完全依賴宿主細(xì)胞DNA的復(fù)制機(jī)制，復(fù)制主要發(fā)生在細(xì)胞周期的S期晚期和G2早期，病毒的接種最好采用同步接種方式。所以，在試驗(yàn)中采用了同步接毒的辦法。但由于樣本的毒性，可以在傳代后6～8 h再接種，能減少樣本對(duì)細(xì)胞的影響。

3.2病毒鑒定

通過(guò)對(duì)分離的病毒進(jìn)行理化鑒定，發(fā)現(xiàn)所分離的病毒具有抗酸、抗脂溶劑和耐熱的特性，與文獻(xiàn)報(bào)道的細(xì)小病毒的理化性質(zhì)一致。通過(guò)對(duì)不同動(dòng)物紅細(xì)胞的血凝譜測(cè)定，所分離病毒能夠凝集豬的紅細(xì)胞，不能凝集雞、兔和人的紅細(xì)胞，與報(bào)道的CPV的血凝譜一致。病毒除了能在F81細(xì)胞增殖外，病毒株2還可以在MDCK細(xì)胞增殖。病毒血凝抑制試驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)所分離的病毒血凝特性能夠被犬特異性細(xì)小病毒血清抑制，證明試驗(yàn)中分離到的病毒為犬細(xì)小病毒。

3.3動(dòng)物回歸試驗(yàn)

為了檢驗(yàn)所分離犬細(xì)小病毒的致病性，進(jìn)行了動(dòng)物回歸試驗(yàn)，分別將3株病毒人工接種試驗(yàn)犬。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組均發(fā)病，表現(xiàn)為拉稀、脫水、精神沉郁、食欲廢絕，對(duì)照組健康。

本試驗(yàn)采用F81細(xì)胞同步接毒的方式從送檢的疑似CPV感染的30份樣品中分離出3份CPV陽(yáng)性樣品。并對(duì)分離病毒進(jìn)行了生物學(xué)和動(dòng)物接種試驗(yàn)，檢驗(yàn)了分離病毒的致病性。其中分離株3可以引起接種幼犬死亡，表明是一株犬細(xì)小病毒的強(qiáng)毒株。本研究為犬細(xì)小病毒病的預(yù)防和控制提供了理論依據(jù)，同時(shí)為深入研究該病毒的致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 馬景霞.犬細(xì)小病毒研究進(jìn)展[J].山東畜牧獸醫(yī)，2008，29（5）：47-49.

[2] 趙世華，宋愛軍，陳偉，等.犬細(xì)小病毒（CPV）內(nèi)蒙古分離株的體外培養(yǎng)特性研究[J].畜牧與飼料科學(xué)，2010，31（9）：168-169.

[3] 殷震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)[M].第二版.北京：科學(xué)出版社，1997.

[4] 王淑君，楊松濤，陳創(chuàng)夫，等.犬細(xì)小病毒四川流行株分離鑒定及其遺傳進(jìn)化分析[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，9（10）：1888-1890.

[5] 劉志強(qiáng)，張小鶯，黃新，等.新疆石河子地區(qū)犬細(xì)小病毒的分離鑒定與基因型分析[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2010，46（8）：44-46.

[6] 蔡寶祥.家畜傳染病學(xué)[M].第5版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2006：422-425.

[7] 戈銳，彭廣能，夏咸柱，等.犬細(xì)小病毒四川株的分離與鑒定[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，29（11）：836-839.

[8] 楊龍峰，李英杰，艾萍萍，等.一株犬細(xì)小病毒的分離及VP2基因序列分析[J].山東畜牧獸醫(yī)，2011，32（1）：6-8.

[9] 易立.犬細(xì)小病毒的分離鑒定、序列分析及VP2基因的融合表達(dá)[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2008.

[10] 杜強(qiáng)，邱薇，范泉水，等.犬細(xì)小病毒的分離鑒定[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30（3）：55-58.

[11] 宋桂強(qiáng)，龍貴偉，范泉水，等.犬細(xì)小病毒病的研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2007，34（3）：98-100.

[12] 張仁舟，楊松濤，馮昊，等.中國(guó)國(guó)內(nèi)首次檢測(cè)到犬細(xì)小病毒CPV2c[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2010，5（4）：246-249.

[13] 魏巍，李肖梁，帥江冰，等.犬細(xì)小病毒HZ0761株的分離與鑒定[J].畜牧與獸醫(yī)，2008，40（7）：1-4.