趙虹 張宇飛 林梅 廖芳麗 熊先鋒 涂書新 張凱

摘要：試驗(yàn)將同一樣品用不同引物檢測純度，發(fā)現(xiàn)不同引物檢出的純度結(jié)果不同。用SSR法檢出的純度結(jié)果不同引物之間的誤差隨著樣品田間純度的增高而呈現(xiàn)出降低的趨勢。當(dāng)品種不同時(shí)，室內(nèi)檢測結(jié)果有可能高于或低于田間鑒定結(jié)果。因此難以找到普遍適用的室內(nèi)與室外檢測的系統(tǒng)誤差校正方法。

關(guān)鍵詞：兩系雜交稻；同一樣品；不同引物；SSR法；田間鑒定；純度比較

中圖分類號：S511；Q789文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：0439-8114（2012）20-4458-02

利用SSR分子標(biāo)記鑒定兩系雜交稻種子純度，具有快速、穩(wěn)定、重復(fù)性好、多態(tài)性高的優(yōu)點(diǎn)，是目前室內(nèi)鑒定兩系雜交稻種子純度時(shí)應(yīng)用最為廣泛的分子標(biāo)記方法。該方法一般是從大量的引物中篩選出多態(tài)性高、共顯性強(qiáng)、雙親譜帶清晰的一對引物，然后用這對引物來鑒定兩系雜交稻種子的純度[1-5]。在試驗(yàn)操作中篩選出的引物往往不止一種，這些引物對同一品種都具有多態(tài)性，且都符合引物篩選的標(biāo)準(zhǔn)。這就意味著多對引物都可用于一個(gè)品種的純度鑒定，為篩選引物和鑒定品種提供了方便。就完全相同的一份樣品而言，用不同引物鑒定是否都能得出相同的純度結(jié)果，很少見諸報(bào)道[6-10]。此次研究的目的在于探討同一樣品用3～4對不同的引物檢測純度，并與田間鑒定結(jié)果比對，分析不同引物檢測結(jié)果的差異，判斷不同引物檢測兩系雜交稻種子純度的準(zhǔn)確性和可靠性。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)所用品種苯兩優(yōu)639、天兩優(yōu)616、兩優(yōu)17均為湖北省種子管理局提供，2010年已做過田間正季鑒定，分別代表全省當(dāng)年種子純度高、中、低3個(gè)類型的樣本群體。

所用引物及試劑均由北京鼎國生物有限公司提供。

1.2引物選擇和DNA模板制備

各品種所用的引物已由前面試驗(yàn)篩選出，其中兩優(yōu)17和天兩優(yōu)616選用4對引物，苯兩優(yōu)639選用3對引物（表1）。DNA模板的制備采用農(nóng)業(yè)部推薦的簡易法，其中，用于SSR引物篩選的DNA模板為田間10個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單株的混合物，用于種子純度鑒定的DNA模板為樣品單株DNA提取物。

1.3PCR反應(yīng)體系

PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積10 μL：10×buffer 1 μL，10 mmol/L dNTP 0.2 μL，50 ng/μL primer 0.2 μL+0.2 μL，2 U/μL Taq 酶0.6 μL，25 ng/μL DNA 1 μL，ddH2O 6.8 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，循環(huán)參數(shù)為94 ℃、15 s，55 ℃、15 s，72 ℃、30 s；最后在72 ℃下延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在含EB的3%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳后，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)觀察記錄。

1.4田間純度鑒定及單株定位方法

以上3個(gè)品種都進(jìn)行了田間正季鑒定，于2011年4月15日播種，5月15日移栽。每品種田間種植1個(gè)小區(qū)，每小區(qū)500株，50行，每行10株，行距26.7 cm，株距16.7 cm。每個(gè)植株用4位數(shù)編號，前兩位數(shù)代表所在的行數(shù)，后兩位數(shù)表示所在行的位置，例如0508表示第五行的第八株，并設(shè)親本對照。在抽穗前及齊穗后分兩次按GB/T 3543.5—1995進(jìn)行田間純度鑒定，并觀察比較各品種間的植物學(xué)形態(tài)特征和生物學(xué)特性。

1.5室內(nèi)鑒定

在秧苗移栽20 d后，在田間按植株編號逐株剪取倒數(shù)第二葉，用于SSR法室內(nèi)純度檢測，其中兩優(yōu)17有效鑒定株數(shù)495株，天兩優(yōu)616有效鑒定株數(shù)316株，苯兩優(yōu)639有效鑒定株數(shù)344株。

1.6室內(nèi)及田間鑒定結(jié)果比對

將同一品種使用不同引物作出的室內(nèi)鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果比較，并比較不同引物室內(nèi)鑒定結(jié)果之間的差異，判斷不同引物檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性與一致性。

2結(jié)果與分析

2.1同一樣品不同方法的鑒定結(jié)果比較

無論是田間方法還是室內(nèi)方法鑒定，3個(gè)樣品的純度從低到高依次為兩優(yōu)17、天兩優(yōu)616、苯兩優(yōu)639（表2）。

室內(nèi)鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果是不一致的。室內(nèi)鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果比較，兩優(yōu)17的4對不同引物鑒定結(jié)果中，與田間鑒定結(jié)果差距最小的為RM212，比田間純度低1.2個(gè)百分點(diǎn)，差距最大的為RM21，比田間純度低5.2個(gè)百分點(diǎn)；苯兩優(yōu)639的3對不同引物鑒定結(jié)果中，與田間鑒定結(jié)果差距最小的為RM17和RM208，均比田間純度高0.2個(gè)百分點(diǎn)，差距最大的為RM263，比田間純度高0.8個(gè)百分點(diǎn)；天兩優(yōu)616的4對不同引物鑒定結(jié)果中，與田間鑒定結(jié)果差距最小的為RM243，比田間純度高1.0個(gè)百分點(diǎn)，差距最大的為RM263，比田間純度高3.2個(gè)百分點(diǎn)。就不同品種而言，有的室內(nèi)純度鑒定結(jié)果高于田間鑒定結(jié)果，有的室內(nèi)純度鑒定結(jié)果低于田間鑒定結(jié)果，其中，兩優(yōu)17的室內(nèi)鑒定，所有引物鑒定結(jié)果純度都比田間低，平均低2.6個(gè)百分點(diǎn)；天兩優(yōu)616的室內(nèi)鑒定，所有引物鑒定結(jié)果純度都比田間高，平均高1.8個(gè)百分點(diǎn)；苯兩優(yōu)639的室內(nèi)鑒定，所有引物鑒定結(jié)果純度都比田間高，平均高0.4個(gè)百分點(diǎn)。

2.2同一樣品不同引物檢測結(jié)果比較

同一樣品不同引物檢出純度有差異。兩優(yōu)17引物間純度最大相差4.0個(gè)百分點(diǎn)，達(dá)4.67%；與田間純度比較最大相差5.2個(gè)百分點(diǎn)，達(dá)6.08%，這已經(jīng)超出了誤差允許范圍。天兩優(yōu)616引物間純度最大相差2.2個(gè)百分點(diǎn)，達(dá)2.30%；與田間純度比較最大相差3.2個(gè)百分點(diǎn)，達(dá)3.35%。苯兩優(yōu)639各引物間純度相近，與田間純度鑒定結(jié)果也基本一致，可見室內(nèi)SSR檢出純度是田間純度的近似值。

3結(jié)論與討論

試驗(yàn)中，純度較高的種子樣品室內(nèi)多對引物的SSR法和田間鑒定的結(jié)果差異較小，否則差異較大。同時(shí)也存在下述問題，值得探討。

3.1引物篩選時(shí)，應(yīng)該關(guān)注引物對樣品的針對性

兩優(yōu)17用引物RM21檢出的純度為85.5%，比目前公認(rèn)的田間鑒定法低5.2個(gè)百分點(diǎn)，相對誤差達(dá)6.08%，已超出了統(tǒng)計(jì)學(xué)可忽略的誤差范圍。而引物RM212檢出的純度為89.5%，比田間鑒定法低1.2個(gè)百分點(diǎn)，接近大田生產(chǎn)鑒定結(jié)果，說明引物對樣品純度的分子生物學(xué)鑒別能力不同。因此，當(dāng)樣品純度較低時(shí)，篩選出的引物對樣品是否有針對性顯得尤為重要。

3.2室內(nèi)鑒定與田間鑒定結(jié)果之間有差距，且差距變化的方向不確定

從試驗(yàn)中看出，受檢品種用SSR法檢測的純度結(jié)果有的高于田間純度鑒定結(jié)果，有的低于田間純度鑒定結(jié)果，誤差的變化方向擺動(dòng)不定。例如兩優(yōu)17用多個(gè)引物檢出的純度均低于田間純度，而天兩優(yōu)616均高于田間純度。這說明室內(nèi)與田間兩種純度檢測方法所測出的結(jié)果之間具有復(fù)雜性，而尋求某種簡便通用的誤差校正方法存在較大的難度。

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