譚鳳霞 吳全超
摘要:以嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7966和分離自養(yǎng)殖水環(huán)境及患病鯽魚(yú)的氣單胞菌(Aeromonas)為試驗(yàn)菌株,通過(guò)肉湯二倍稀釋法研究二氧化氯的抑菌及殺菌效果。結(jié)果表明,二氧化氯在低濃度時(shí)能抑制氣單胞菌的生長(zhǎng)增殖,高濃度時(shí)能殺滅細(xì)菌,其對(duì)ATCC7966、T1、T3、T4、T5、T6菌株的最小抑菌濃度(MIC)為12 mg/L,對(duì)T2菌株的最小抑菌濃度為24 mg/L;二氧化氯對(duì)ATCC7966、T1、T3、T4菌株的最小殺菌濃度(MBC)為96 mg/L,對(duì)T2、T5、T6菌株的最小殺菌濃度為384 mg/L。研究結(jié)果能為二氧化氯在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的合理使用提供一定的依據(jù)。
關(guān)鍵詞:二氧化氯;氣單胞菌(Aeromonas);最小抑菌濃度;最小殺菌濃度
中圖分類(lèi)號(hào):S859.79+9.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):0439-8114(2012)03-0567-04
Research on Bacteriostatic and Bactericidal Effect of Chlorine Dioxide on Aeromonas
TAN Feng-xia,WU Quan-chao
(School of Animal Sciences, Yangtze University, Jingzhou 434025, Hubei, China)
Abstract: Aeromonas bacteria strains, including the standard bacteria Aeromonas hydrophila and the Aeromonas bacteria strains which isolated from the culture water or diseased fish, were used to investigate the bacteriostatic and bactericidal efficacy of chlorine dioxide to Aeromonas bacterium by double broth dilution method. The results showed that the chlorine dioxide could inhibit the growth of bacterium at the lower concentration, and killed the bacterium at the higher concentration. The minimal inhibitory concentration(MIC) of chlorine dioxide to seven Aeromonas bacterium are 12 mg/L to strians ATCC7966, T1, T3, T4, T5 and T6, and 24 mg/L to strain T2; The minimal bactericidal concentration(MBC) of chlorine dioxide to Aeromonas are 96 mg/L to strians ATCC7966, T1, T3 and T4, and 384 mg/L to strains T2, T5 and T6. These results provided the scientific basis for reasonable application of chlorine dioxide.
Key words: chlorine dioxide; Aeromonas; MIC; MBC
氣單胞菌屬(Aeromonas)廣泛分布于自然界,其中嗜水氣單胞菌(A. hydrophila)、豚鼠氣單胞菌(A. caviae)及溫和氣單胞菌(A. sobria)等已被確認(rèn)是多種水產(chǎn)動(dòng)物重要的病原菌,常給養(yǎng)殖生產(chǎn)帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。二氧化氯作為水產(chǎn)養(yǎng)殖上常用的消毒劑,不僅能大幅度減少養(yǎng)殖水體中致病微生物的數(shù)量,而且不損害浮游生物,對(duì)水體具有消毒、增氧作用[2],對(duì)魚(yú)類(lèi)的出血性敗血病、爛鰓病、赤皮病、腸炎、水霉病和對(duì)蝦的弧菌病、病毒病等均有顯著療效。經(jīng)農(nóng)業(yè)部新漁藥臨床試驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)定,穩(wěn)定性二氧化氯無(wú)刺激性、不損傷水生生物,能改善水質(zhì),與其他對(duì)照藥物相比,具有殺菌時(shí)間短、副作用小等優(yōu)點(diǎn),可用于水產(chǎn)品育苗[3-10]。本研究以嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7966、分離自患病鯽魚(yú)和養(yǎng)殖水環(huán)境中的氣單胞菌作為試驗(yàn)菌株,研究二氧化氯對(duì)氣單胞菌的抑菌及殺菌效果,為二氧化氯在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的合理使用提供依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料
二氧化氯制劑(購(gòu)自四川華強(qiáng)漁牧藥業(yè)有限公司,規(guī)格100 g/袋,含8.0 g亞氯酸鈉);培養(yǎng)基為牛肉膏液體和固體培養(yǎng)基,pH (7.0±0.2),中和劑(5 g/L硫代硫酸鈉和5 g/L吐溫-80);試驗(yàn)所用其他試劑均為分析純。
供試菌株嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7966購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物保藏中心;氣單胞菌T1和T2菌株分離自患病鯽魚(yú);氣單胞菌T3、T4、T5和T6菌株均分離自養(yǎng)殖水環(huán)境。
1.2方法
1.2.1菌懸液的制備將各供試菌株純培養(yǎng)物用單倍營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng),經(jīng)增菌搖床過(guò)夜培養(yǎng),取24 h新鮮培養(yǎng)物加甘油置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?,試?yàn)前1 d取出接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面,28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后取出,用胰蛋白胨生理鹽水溶液(TPS)洗下菌苔,制成菌懸液,分別取各菌懸液與有機(jī)干擾物(3%牛血清白蛋白)以1∶1的體積比混合制備成試驗(yàn)菌懸液,備用。
1.2.2二氧化氯對(duì)氣單胞菌最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定用蒸餾水將二氧化氯制劑稀釋成8?jìng)€(gè)濃度梯度的受試液,折合二氧化氯含量分別為3、6、12、24、48、96、192、384 mg/L;依次取各稀釋度受試液2.5 mL加入到含2.5 mL雙倍濃度營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管中,然后接種0.1 mL含菌量約為108 CFU/mL的菌懸液,作為試驗(yàn)組。以同樣方法接種各供試菌株菌懸液于不含二氧化氯制劑的營(yíng)養(yǎng)肉湯中,作為陽(yáng)性對(duì)照組。陰性對(duì)照組只含營(yíng)養(yǎng)肉湯,不接種細(xì)菌。28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,觀(guān)察結(jié)果。通過(guò)觀(guān)察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況,確定二氧化氯對(duì)氣單胞菌的MIC。
當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照組有細(xì)菌生長(zhǎng)(渾濁),陰性對(duì)照組無(wú)菌生長(zhǎng)(透明),試驗(yàn)組中無(wú)菌生長(zhǎng)的最低二氧化氯濃度即為二氧化氯對(duì)該供試菌株的MIC。
1.2.3二氧化氯對(duì)氣單胞菌最小殺菌濃度(MBC)的測(cè)定在MIC測(cè)定試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行MBC的測(cè)定,MIC測(cè)定試驗(yàn)培養(yǎng)24 h后,觀(guān)察結(jié)果,分別吸取試驗(yàn)組中無(wú)菌生長(zhǎng)的抗(抑)菌劑0.5 mL于含4.5 mL中和劑溶液的試管中,混勻,作用10 min;吸取中和后的樣液2.5 mL加入到含2.5 mL雙倍濃度營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管中。同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組、中和劑對(duì)照組。28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,觀(guān)察結(jié)果。
當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照組有細(xì)菌生長(zhǎng)(渾濁),陰性對(duì)照組無(wú)菌生長(zhǎng)(透明),中和劑對(duì)照組無(wú)菌生長(zhǎng)(透明),試驗(yàn)組中無(wú)菌生長(zhǎng)的最低二氧化氯濃度即二氧化氯對(duì)該供試菌株的MBC。
2結(jié)果與分析
2.1二氧化氯對(duì)氣單胞菌的抑菌作用
各菌株在含有不同濃度的二氧化氯的營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)24 h后觀(guān)察二氧化氯對(duì)各氣單胞菌菌株的抑菌作用,結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知,陽(yáng)性對(duì)照組試管均渾濁,表示7種供試菌株在24 h內(nèi)均能存活或增殖,陰性對(duì)照組各試管均透明,表示培養(yǎng)液無(wú)菌。試驗(yàn)組各試管在不同濃度下表現(xiàn)為透明或渾濁現(xiàn)象,其中二氧化氯濃度在6 mg/L及以下濃度時(shí),試驗(yàn)組各試管 (T2菌株除外)均表現(xiàn)為渾濁現(xiàn)象,表示二氧化氯在該濃度下不能抑制細(xì)菌的生長(zhǎng),而二氧化氯濃度在12 mg/L及以上濃度時(shí),各試管(T2菌株除外)均表現(xiàn)為透明現(xiàn)象,表示在該濃度下細(xì)菌的生長(zhǎng)被抑制;T2菌株組在二氧化氯濃度為12 mg/L及以下濃度時(shí)表現(xiàn)為渾濁現(xiàn)象,在24 mg/L及以上濃度時(shí),二氧化氯能抑制T2菌株的生長(zhǎng)。
2.2二氧化氯對(duì)氣單胞菌的殺菌作用
在二氧化氯抑菌試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,加入中和劑中和二氧化氯制劑的殘留作用,在營(yíng)養(yǎng)肉湯中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后觀(guān)察二氧化氯對(duì)各氣單胞菌菌株的殺菌作用,結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知,陽(yáng)性對(duì)照組各試管均渾濁,表明7種供試菌株在24 h內(nèi)均能存活或增殖;陰性對(duì)照組各試管均透明,表明培養(yǎng)液無(wú)菌生長(zhǎng);中和劑對(duì)照組各試管均透明,表明中和劑無(wú)菌。試驗(yàn)組各試管在不同濃度下表現(xiàn)為透明或渾濁現(xiàn)象,其中ATCC7966、T1、T3、T4菌株在二氧化氯濃度為48 mg/L及以下濃度時(shí),而T2、T5、T6菌株則在二氧化氯濃度為192 mg/L及以下濃度時(shí),試驗(yàn)組各試管表現(xiàn)出渾濁現(xiàn)象,表明該濃度下的二氧化氯只是抑制了細(xì)菌的生長(zhǎng),不能殺滅細(xì)菌,在二氧化氯的殘留作用被中和劑中和后,細(xì)菌重新開(kāi)始生長(zhǎng)增殖;而ATCC7966、T1、T3、T4菌株在二氧化氯濃度為96 mg/L及以上濃度時(shí),T2、T5、T6菌株則在二氧化氯濃度為384 mg/L及以上濃度時(shí),試驗(yàn)組各試管均表現(xiàn)為透明現(xiàn)象,即在二氧化氯的殘留作用被中和劑中和后,培養(yǎng)液中無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖,表明在該濃度下細(xì)菌已被殺滅。
2.3二氧化氯對(duì)氣單胞菌的MIC和MBC
根據(jù)二氧化氯對(duì)氣單胞菌的MIC及MBC的評(píng)判方法,抑菌試驗(yàn)中無(wú)菌生長(zhǎng)的最低二氧化氯濃度即為二氧化氯對(duì)該供試菌株的MIC,殺菌試驗(yàn)中無(wú)菌生長(zhǎng)的最低二氧化氯濃度即為二氧化氯對(duì)該供試菌株的MBC。二氧化氯對(duì)7種供試菌株的MIC和MBC見(jiàn)表3。在本試驗(yàn)所設(shè)定的濃度梯度下,二氧化氯對(duì)各氣單胞菌菌株的MIC為12 mg/L(對(duì)T2菌株的MIC為24 mg/L);而二氧化氯對(duì)各氣單胞菌菌株的MBC有所不同,其中對(duì)ATCC7966、T1、T3、T4菌株的MBC為96 mg/L,但對(duì)T2、T5、T6菌株的MBC為384 mg/L。
3討論
氣單胞菌廣泛存在于養(yǎng)殖水環(huán)境中,是重要的水生動(dòng)物病原菌之一。二氧化氯是水產(chǎn)養(yǎng)殖上常用的消毒劑之一,目前應(yīng)用于池塘水體消毒的二氧化氯有一元二氧化氯和二元二氧化氯兩種。二元二氧化氯對(duì)水生動(dòng)物致病菌的抑菌及殺菌效果的研究已展開(kāi),江為民等[3]測(cè)定了二氧化氯對(duì)10種甲魚(yú)致病菌在營(yíng)養(yǎng)肉湯中的MIC和在池塘水體中的MBC,結(jié)果表明,二氧化氯在營(yíng)養(yǎng)肉湯中對(duì)病原菌有一定的抑菌作用,對(duì)其中6種致病菌的MIC小于25 μg/mL;二氧化氯對(duì)池塘水體的殺菌效果較理想,對(duì)其中7種致病菌的MBC小于6.25 μg/mL,以作用30 min殺菌效果最佳,認(rèn)為二氧化氯在甲魚(yú)病害防治上是一種較有前途的藥物。艾曉輝等[4]在13~15 ℃條件下,測(cè)定了二氧化氯制劑(亞氯酸鹽與酸性活化劑質(zhì)量比1∶1)對(duì)嗜水氣單胞菌9120和T3菌株、魚(yú)害粘球菌(Myxococcus piscicola)G4菌株、腸型點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌(A.punctata f. intertinalis)58-20-9菌株、熒光極毛桿菌(Pseudomonas fluorescens)56-12-10菌株、點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌點(diǎn)狀亞種(A. punctata sub. punctata)ST78-3-3菌株、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)E3-11菌株等7種水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物致病菌作用30 min的MBC分別為3.12、3.12、1.56、12.50、25.00、6.25、12.50 μg/mL。陳超然等[5]測(cè)定了二氧化氯對(duì)柱狀嗜纖維菌(Cytophaga columnaris)GCR-9061菌株和SC-2菌株的MBC分別為1.56 mg/L和0.78 mg/L;對(duì)嗜水氣單胞菌BS-6菌株和ZHB-7菌株的MBC分別為1.56 mg/L和0.78 mg/L;對(duì)鰻弧菌(Vibrio anguillarum)J-O-1菌株和K-3菌株的MBC分別為3.13 mg/L和1.56 mg/L;對(duì)遲鈍愛(ài)德華氏菌(Edwardsiella tarda,Et)EF-1菌株和ET-12菌株的MBC均為1.56 mg/L。劉小燕等[6]測(cè)定了二氧化氯對(duì)腸型點(diǎn)狀氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、柱狀曲橈桿菌(Flexibacter columnaris)的MIC分別為0.17、0.17、0.06 μg/mL,MBC分別為0.23、0.23、0.17 μg/mL。而本試驗(yàn)所用二氧化氯為一元二氧化氯,其規(guī)格為100 g二氧化氯制劑中含有效成分亞氯酸鈉8.0 g,在試驗(yàn)設(shè)定的濃度梯度下,二氧化氯對(duì)各氣單胞菌菌株的MIC為12 mg/L(對(duì)T2菌株的MIC為24 mg/L),而二氧化氯對(duì)各氣單胞菌菌株的MBC有所不同,其中對(duì)ATCC7966、T1、T3、T4菌株的MBC為96 mg/L,但對(duì)T2、T5、T6菌株的MBC為384 mg/L;但是,由于試驗(yàn)觀(guān)察到從渾濁變?yōu)橥该鞯臐舛确秶^大,如T2、T5、T6菌株MBC的范圍為192~384 mg/L,所以二氧化氯對(duì)7種供試菌株的MIC或MBC實(shí)際值可能要低于本試驗(yàn)確定的數(shù)值。一元二氧化氯配制方法簡(jiǎn)單,使用相對(duì)比較安全,但受含量的限制(不得高于10%),其施用效果往往不盡如人意。二元二氧化氯含量高,為A、B兩種分裝,A主要成分為亞氯酸鈉和穩(wěn)定劑碳酸鈉,B的主要成分為活化劑檸檬酸等。
本試驗(yàn)分別采用嗜水氣單胞菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7966、分離自患病鯽魚(yú)以及養(yǎng)殖水環(huán)境中的氣單胞菌為試驗(yàn)菌株,研究二氧化氯作為水產(chǎn)養(yǎng)殖上常用消毒劑的抑菌及殺菌效果,這一結(jié)果可為二氧化氯的合理使用提供一定的依據(jù)。
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收稿日期:2011-07-20
基金項(xiàng)目:長(zhǎng)江大學(xué)博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目(801200010110)
作者簡(jiǎn)介:譚鳳霞(1979-),女,山東濰坊人,講師,博士,主要從事微生物學(xué)方面的研究工作,(電話(huà))13227640356(電子信箱)
tanfengxia2008@163.com。