王進產(chǎn) 焦金波 何翠 張海洋 喬榮岑 白朝勇 孫進忠

摘 要：目的：使用BelloCell-500AP生物反應(yīng)器和BioNOC?-II 微載體，對BHK21細胞在此新型高密度培養(yǎng)生物反應(yīng)器中的生長特性進行研究。方法：首先將1.5×108個BHK21細胞懸液加入含有微載體的生物反應(yīng)器內(nèi)，按生物反應(yīng)器廠家推薦參數(shù)進行培養(yǎng)，每天取載體計數(shù)觀察BHK21的生長特性。然后調(diào)整細胞濃度和微載體培養(yǎng)系統(tǒng)運行參數(shù)。結(jié)果：BHK21細胞經(jīng)過6 d培養(yǎng)載體中細胞總數(shù)達到峰值，細胞密度是起始接入數(shù)量的31倍為4.41×109個；經(jīng)過培養(yǎng)過程參數(shù)優(yōu)化，確定適于BHK21細胞高密度培養(yǎng)參數(shù)。試驗成功實現(xiàn)了BHK21細胞的高密度培養(yǎng)，為以BHK21細胞為生產(chǎn)基質(zhì)的病毒疫苗生產(chǎn)提供了一條簡便快捷的途徑。

關(guān)鍵詞：生物反應(yīng)器 微載體 BHK21細胞

中圖分類號：S852．659 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1674-098X（2012）12（b）-00-02

目前我國獸醫(yī)生物制品生產(chǎn)過程中，細胞培養(yǎng)設(shè)備相對比較落后，大多是在轉(zhuǎn)瓶內(nèi)旋轉(zhuǎn)貼壁培養(yǎng)，不僅勞動強度大、操作復(fù)雜、容易造成污染，還經(jīng)常出現(xiàn)細胞貼壁不均造成不同批次細胞的差異。為了提高產(chǎn)量，只有通過增加培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶數(shù)，而這往往受到生產(chǎn)場地的限制，而生物反應(yīng)器就彌補了這些不足。BelloCell-500AP是美國Cesco公司研發(fā)的一種能有效地使細胞內(nèi)外營養(yǎng)和氣體交換的新型固定床式生物反應(yīng)器。在國內(nèi)外該生物反應(yīng)器已經(jīng)廣泛應(yīng)用于HEK 293、Vero、CHO、SF-9、ST等多種哺乳動物細胞和昆蟲細胞的培養(yǎng)[1-8]。BHK21細胞廣泛用于口蹄疫、狂犬病毒、乙腦病毒等病毒疫苗的生產(chǎn)基質(zhì)，BHK21細胞在純懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)和攪拌式微載體培養(yǎng)系統(tǒng)的報道比較多。本研究使用新型潮汐式固定床微載體培養(yǎng)系統(tǒng)BelloCell-500AP和BioNOC -II 片狀微載體對BHK21在微載體生長特性進行研究，探索細胞增殖規(guī)律，為口蹄疫、狂犬病毒、乙腦病毒在這一新型反應(yīng)器培養(yǎng)工藝研究作鋪墊。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

BHK21細胞（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所），DMEM培養(yǎng)基（Gibco），胎牛血清（PAA），葡萄糖（Sigma），BelloCell-500AP高密度細胞培養(yǎng)系統(tǒng)（CESCO）

1.2 試驗方法

1.2.1 微載體培養(yǎng)BHK21細胞方法（1）細胞的接種后貼壁階段將長滿單層BHK21細胞轉(zhuǎn)瓶消化后計數(shù)，取1.5×108顆細胞于30 mL培養(yǎng)基內(nèi)備用，將470 mL含5% FBS的DMEM倒入BelloCell-500AP中，然后將準(zhǔn)備好的BHK21細胞均勻地加入載體上，然后置于BelloStage機器，啟動吸附程序。

（2）細胞的接種后培養(yǎng)階段 吸附結(jié)束后啟動培養(yǎng)程序，24 h后無菌條件下將載體瓶與2 L儲液罐連接，啟動換液程序。

1.2.2 細胞在微載體培養(yǎng)過程的培養(yǎng)參數(shù)的檢測

（1）細胞核染色計數(shù)

從BelloCell-500AP取6片載體分裝于3個含CVD（結(jié)晶紫、Triton X-100、EDTA）的1.5 mL EP管中，每管分裝2片。震蕩1 min后，將其置于37 ℃孵育，每隔15～20 min震蕩1次，60 min后取出PBS作2～50倍稀釋，取10 μL于細胞計數(shù)板加樣孔進行計數(shù)，計算3個EP管中載體上的細胞總數(shù)，然后計算出每片載體片上的細胞數(shù)，根據(jù)Bellocell-500含有載體數(shù)（約865±5片）計算1個載體瓶所細胞總數(shù)。

（2）細胞狀態(tài)和生長密度

從BelloCell-500AP取含有細胞的載體片放入已含95%酒精的1.5 mL離心管中浸泡5 min，將細胞脫水并固定，棄去95%酒精并以PBS洗滌一次，然后加入H&E（Hematoxylin）染色劑染10 min用超純水沖洗，將載體置于顯微鏡下觀察細胞在微載體成長狀態(tài)和密度。

（3）培養(yǎng)過程中pH值

無菌條件下分別從BelloCell-500AP和2 L儲液罐取出少量液體，酸度計測定其pH值，根據(jù)pH值的高低分析細胞增殖對培養(yǎng)基酸堿度的影響，進而根據(jù)pH變化決定試驗結(jié)束時間。

1.3 細胞在微載體培養(yǎng)過程中培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.3.1 細胞接種數(shù)量對微載體培養(yǎng)系統(tǒng)下BHK21細胞生長特性的影響細胞接種濃度分別為：（1）1×108個/500 mL，（2）1.5×108個/500 mL），（3）3×108個/500 mL，其他培養(yǎng)參數(shù)同1.2.3中步驟，觀察細胞接種密度對細胞增殖特性的影響。

1.3.2 微載體培養(yǎng)系統(tǒng)運行參數(shù)對BHK21細胞貼壁的影響微載體培養(yǎng)系統(tǒng)細胞貼壁階段運行時分別于細胞接種后2 h、2.5 h、3 h、3.5 h和4 h取出6片載體按1.3.1中的方法對載體中細胞進行計數(shù)，根據(jù)載體中細胞數(shù)和接入的細胞總數(shù)，計算不同貼壁時間細胞與載體的吸附情況。

1.3.3 微載體培養(yǎng)系統(tǒng)運行參數(shù)對BHK21細胞增殖特性的影響

（1）培養(yǎng)液流速對細胞增殖的影響 微載體培養(yǎng)系統(tǒng)細胞培養(yǎng)階段，培養(yǎng)液流動速率分別設(shè)定為1 mm/s、2 mm/s、4 mm/s，其他培養(yǎng)參數(shù)同1.2.3中步驟，觀察細胞接種密度對細胞增殖特性的影響。

（2）頂部停留時間對細胞增殖的影響 微載體培養(yǎng)系統(tǒng)細胞培養(yǎng)階段，液體在載體罐（BelloCell-500AP）頂部停留時間分別為0 s、10 s和30 s，其他培養(yǎng)參數(shù)同1.2.3中步驟，觀察其對細胞增殖的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同培養(yǎng)時間細胞染色觀察

不同培養(yǎng)時間的載體片經(jīng)固定和H&E（Hematoxylin）染色后發(fā)現(xiàn)細胞接種后24 h在載體纖維狀的基質(zhì)上有少量散在細胞，并在培養(yǎng)初期（0～96 h）絕大部分細胞是沿著基質(zhì)增殖的，到96 h細胞已經(jīng)鋪滿整個基質(zhì)見圖1A （94 h），隨后細胞增殖主要發(fā)生在載體基質(zhì)與基質(zhì)之間，并在144 h細胞已鋪滿整個載體，見圖1的B。

2.2 BHK21細胞在BelloCell-500AP中生長特性

BelloCell -500AP起始細胞接種量為1.5×108，經(jīng)過6 d培養(yǎng)，BelloCell-500AP載體內(nèi)細胞數(shù)通過CVD細胞核染色計數(shù)達最高細胞密度是起始密度的31.73倍。細胞接入24 h內(nèi)細胞增殖較慢，在細胞接種后24～96 h細胞進入快速增殖期。細胞接入接種96 h時載體內(nèi)細胞總數(shù)為3.28×109，是起始密度的23.60倍。隨后細胞增殖放緩，細胞培養(yǎng)120 h時載體上細胞總數(shù)僅為96 h的1.26倍，細胞培養(yǎng)144 h載體上的細胞數(shù)為120 h的1.07倍。由于此時載體瓶中的pH值已經(jīng)降至7.0以下，試驗結(jié)束。

2.3 細胞接種密度對細胞生長特性的影響

在生物反應(yīng)器培養(yǎng)固定化細胞的培養(yǎng)過程中，所接種細胞量亦是影響所培養(yǎng)細胞生長濃度的關(guān)鍵影響因素，探討片狀載體材料用于培養(yǎng)BHK21細胞時細胞承載量，貼附于固定化載體材料上細胞密度的多寡，亦是之后細胞大量復(fù)制生長濃度高低的重要因素。在此試驗中設(shè)計了3組不同細胞接種濃度在生物反應(yīng)器生長曲線見圖2所示。

圖2 不同細胞接種量對BHK21細胞生長的

影響

由圖可以看以第2組和第3組生長曲線比較接近，兩者在經(jīng)過144 h培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)兩則的細胞數(shù)依然很接近，分別為，42.24×108和44.14×108顆細胞。而接種密度最低的第1組培養(yǎng)144h的細胞總數(shù)僅為32.47×108，遠低于另兩組。細胞接種數(shù)量少，細胞種準(zhǔn)備相對容易，因此細胞接種密度為1.5×108個/500 mL時，更適于BHK21細胞在微載體培養(yǎng)系統(tǒng)增值。

2.4 細胞貼壁程序運行時間對BHK21細胞貼壁的影響

BHK21細胞在載體表面上增殖生長主要可以分為貼壁、生長與擴展成單層三個階段 ，其中哺乳動物細胞貼壁階段是決定細胞是否得以大量復(fù)制生長的關(guān)鍵。在本試驗設(shè)定的5貼壁程序運行時間，時間越長吸附到載體上的細胞數(shù)也越多，但到細胞貼壁階段運行3.5 h和4 h，細胞與載體的吸附率差異很小，兩者的貼附效率為92%和93%。為縮短細胞培養(yǎng)時間，選擇3.5 h貼壁程序運行時間更為合適。

2.5 微載體培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液流速對BHK21細胞增殖的影響

培養(yǎng)基流速大小是造成細胞培養(yǎng)系統(tǒng)生物反應(yīng)器剪切力大小的關(guān)鍵因素，本試驗在微載體培養(yǎng)時使用3種不同培養(yǎng)液液流速，在接種密度均為1.5×108個BHK21細胞的生長曲線見圖3。

圖3 不同培養(yǎng)液流速對細胞增殖的影響

由圖可以看出，不同培養(yǎng)液流速對細胞培養(yǎng)早期（0-72 h）細胞生長速度影響很小。培養(yǎng)液流速1 mm/s和2 mm/s的載微載體生物反應(yīng)器在細胞培養(yǎng)72 h計數(shù)算細胞總數(shù)分別為23.7×108個/500 mL和23.4×108個/500 mL，培養(yǎng)液流速為4 mm/s載體瓶中算得的細胞略低，為20.7×108個/500 mL。72 h后不同培養(yǎng)液流速對細胞增殖的影響增加，培養(yǎng)基流速為4 mm/s的載體瓶細胞增殖變緩。培養(yǎng)基流速為2 mm/s的載體瓶中在培養(yǎng)144 h計算出的細胞總數(shù)略多于培養(yǎng)基流速為1 mm/s的載體瓶，前者最大細胞密度為46.5×108/500 mL，而培養(yǎng)液流速為1 mm/s條件下BHK21的峰值為43.4×108/500 mL。因此、培養(yǎng)BHK21細胞在微載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)時培養(yǎng)液流速為2 mm/s更合適。

2.6 微載體培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液在載體瓶頂部停留時間對BHK21細胞增殖的影響

設(shè)計了3組分別為（1）0 s、（2）10 s和（3）30 s 不同頂部停留時間來進行試驗。當(dāng)培養(yǎng)液在BelloCell-500AP頂部停留時，載體完全沒培養(yǎng)液下方，貼附于載體上 BHK21細胞能充分吸收培養(yǎng)液中的養(yǎng)分，但在同時BHK21細胞確無法獲得足夠的氧氣且代謝物停留也會影響細胞生長，因此培養(yǎng)液在BelloCell-500AP頂部停留時間的長短也是影響細胞生長的重要因素之一。本試驗設(shè)定微載體培養(yǎng)系統(tǒng)不同頂部停留時間對BHK21細胞生長影響的試驗結(jié)果

見圖4。

圖4 不同培養(yǎng)液停留時間

對細胞增殖的影響

根據(jù)圖4可看出，營養(yǎng)液頂部停留時間為0 s和10 s時細胞增殖曲線比較接近。但后者培養(yǎng)144 h具有更大的細胞密度為42.77×108個/500 mL。頂部停留時間為30s時，在培養(yǎng)初期（72 h前）細胞生長的速度比另兩組快，但72 h后生長速率明顯放緩，并且培養(yǎng)144 h最大細胞數(shù)為37.53×108個/500 mL。因此，培養(yǎng)液停留10 s時 細胞表現(xiàn)出教佳生長速度。

參考文獻

[1] Ho L，Greene CL，Schmidt AW，and et al.Cultivation of HEK 293 cell line and production of a member of the superfamily of G-protein coupled receptors for drug discovery applications using a highly efficient novel bioreactor）[J].Cytotechnology，2004.

[2] 鄭云程，吳建虹，孫奮勇，等.利用一種新型反應(yīng)器—BelloCcll培養(yǎng)動物細胞[J].生物學(xué)雜志，2010.

[3] 馬良，田宇婧，周建民，等.采用潮汐式生物反應(yīng)器進行ST細胞培養(yǎng)的研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2012.