劉瑩,趙杰,孫延芳

摘要：以水為溶劑提取接骨木（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｗｉｌｌｉａｍｓｉｉ）葉粗多糖，利用苯酚－硫酸比色法測定粗多糖的含量，設(shè)計單因素試驗考察提取溫度、提取時間、料水質(zhì)量比、乙醇濃度、提取次數(shù)以及提取液ｐＨ對多糖提取率的影響，并應(yīng)用正交試驗優(yōu)化提取工藝。結(jié)果表明，優(yōu)化的提取工藝為提取溫度７５ ℃、提取時間３ ｈ、料水質(zhì)量比１∶３０、乙醇體積分?jǐn)?shù)８０％，此條件下接骨木葉粗多糖的提取率為１５．５２％。

關(guān)鍵詞：接骨木（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｗｉｌｌｉａｍｓｉｉ）；粗多糖；提?。粌?yōu)化

中圖分類號：Ｒ２８４．２文獻標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）05－0994-03

Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｅｒｂｅｒｒｙ Ｌｅａｖｅｓ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ

ＬＩＵ Ｙｉｎｇ，ＺＨＡＯ Ｊｉｅ，ＳＵＮ Ｙａｎ－ｆａｎｇ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｆｕｘｉｎ １２３０００，Ｌｉａｏｎｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ｅｒｂｅｒｒｙ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｗｉｌｌｉａｍｓｉｉ） ｕｓｉｎｇ ｗａｔｅｒ ａｓ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｌ－ｓｕｌｆｕｒｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， ｍａｓｓ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｏ ｗａｔｅｒ， ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ， ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅｓ ａｎｄ ｐＨ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｙｓｔｅｍ ｏｎ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔｓ． Ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｗａｓ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ， ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ７５ ℃； Eｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， 3 ｈ； Mａｓｓ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｏ ｗａｔｅｒ， １∶３０； Cｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌ（volumn ratio）， ８０％， ａｎｄ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ １５．５２％．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｅｒｂｅｒｒｙ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｗｉｌｌｉａｍｓｉｉ Ｈａｎｃｅ）； ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ； ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ； ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ

接骨木（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｗｉｌｌｉａｍｓｉｉ Ｈａｎｃｅ）為忍冬科接骨木屬植物，又名續(xù)骨木、大接骨丹、公道老、扦扦活、馬尿騷等，分布于中國東北、華北、華東、華中、云南等地區(qū)［１－３］。接骨木化學(xué)成分復(fù)雜，藥理作用廣泛，臨床用于治療骨質(zhì)疏松和促進骨折愈合療效顯著，是一種很有開發(fā)價值的中藥材［４－１０］。多糖是其主要的藥用成分之一，具有抗感染、抗凝血、抗放射以及降血脂的功能，能夠有效地控制細胞分裂和分化，調(diào)節(jié)細胞生長與衰老［１１－１５］。本研究以水為溶劑提取接骨木多糖，并用苯酚－硫酸比色法測定多糖含量，對接骨木葉粗多糖的提取條件進行了優(yōu)化，以期為接骨木有效成分的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

１材料與方法

１．１試驗材料

本試驗采用阜新地區(qū)的接骨木，２０１０年９月采集，選擇無病蟲害的葉片，清洗干燥后備用。濃硫酸、苯酚、蔗糖等試劑均為分析純，購于沈陽國藥公司。７５２紫外可見分光光度計（上海欣茂儀器有限公司）、高速離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）、冷凍干燥機（寧波新芝生物科技有限公司中佳分公司）、組織搗碎機（上海嘉定糧油儀器有限公司）。

１．２方法

１．２．１標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作?。保爸г嚬?，配制蔗糖含量分別為０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０ μｇ／ｍＬ的蔗糖溶液，然后向試管內(nèi)加入１ ｍＬ體積分?jǐn)?shù)為９％的苯酚溶液，振蕩搖勻，再從管液正面以５～２０ ｓ的速度向液面逐滴加入５ ｍＬ濃硫酸，繼續(xù)振蕩搖勻，直至溶液完全混合，顏色均勻。比色液總體積約為８ ｍＬ，在恒溫下放置３０ ｍｉｎ，顯色，然后以蒸餾水為參比，在４８５ ｎｍ波長下測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［２，３］。得到蔗糖含量（Ｘ//μｇ/ｍＬ）對吸光度Ａ４８５ ｎｍ（Ｙ）的直線回歸方程Ｙ＝０．０１７ ５Ｘ＋０．０３６ ９，相關(guān)系數(shù)Ｒ２＝０．９９４，說明在所取的濃度范圍內(nèi)蔗糖濃度和吸光度呈良好的線性關(guān)系。

１．２．２接骨木葉多糖提取工藝流程取備用的接骨木葉，經(jīng)脫脂、脫色、脫蛋白等處理，然后采用水提醇沉法提取多糖，絮狀沉淀經(jīng)乙醇、乙醚、丙酮洗滌后冷凍干燥，得到粗多糖。

１．２．３單因素試驗分別考察提取溫度、提取時間、料水質(zhì)量比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對多糖提取率的影響［４］。①提取溫度。精確稱取１．０ ｇ脫脂接骨木葉粉末５份，各加入２５ ｍＬ蒸餾水，調(diào)節(jié)ｐＨ至７．０，分別在６５、７５、８５、９５ ℃的恒溫水浴中提?。?ｈ，過濾、收集上清液，測定其Ａ４８５ ｎｍ，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算溶液中多糖的濃度，并計算接骨木葉粗多糖的提取率（粗多糖提取率＝提取所得粗多糖的質(zhì)量／脫脂接骨木粉末質(zhì)量×１００％）。②提取時間。精確稱?。保?ｇ脫脂接骨木葉粉末５份，各加入２５ ｍＬ蒸餾水，調(diào)節(jié)ｐＨ至７．０，然后在７５ ℃恒溫水浴中分別提?。?、２、３、４、５ ｈ后過濾，收集上清液，測定其Ａ４８５ ｎｍ，計算接骨木葉粗多糖的提取率。③料水質(zhì)量比。精確稱?。保?ｇ脫脂接骨木葉粉末５份，分別加入１５、２０、２５、３０、３５ ｍＬ蒸餾水，調(diào)節(jié)ｐＨ至７．０，然后在７５ ℃恒溫水浴中提?。?ｈ后過濾，收集上清液，測定其Ａ４８５ ｎｍ，計算接骨木葉粗多糖的提取率。④乙醇體積分?jǐn)?shù)。精確稱?。保埃?ｇ脫脂接骨木葉粉末５份，各加入２５ ｍＬ蒸餾水，７５ ℃恒溫水浴中提?。?ｈ，水浴后過濾，收集上清液，減壓濃縮，分別加入體積分?jǐn)?shù)為５０％、６０％、７０％、８０％、９０％的乙醇溶液，在４ ℃下沉淀過夜后３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，棄去上清液，收集沉淀，真空干燥，稱取所得粗多糖的質(zhì)量，計算粗多糖得率。

１．２．４正交試驗［５］結(jié)合單因素試驗結(jié)果，設(shè)計Ｌ９（３４）正交試驗，對影響粗多糖得率的提取溫度、提取時間、料水質(zhì)量比和乙醇體積分?jǐn)?shù)４個因素進行優(yōu)化。正交試驗因素與水平見表１。

２結(jié)果與分析

２．１單因素試驗結(jié)果

２．１．１提取溫度對接骨木葉粗多糖提取率的影響在６５～７５ ℃的溫度范圍內(nèi)，粗多糖提取率隨著提取溫度的升高而升高，提取溫度為７５ ℃時，粗多糖提取率最高，提取溫度高于７５ ℃時，粗多糖提取率隨溫度的升高而下降（圖１）。可見較高的提取溫度有利于多糖的溶出，但過高的溫度會使粗多糖降解，反而不利于提高提取率。

２．１．２提取時間對接骨木葉粗多糖提取率的影響在２ ｈ內(nèi)，粗多糖提取率隨著提取時間的延長而升高，但當(dāng)提取時間超過２ ｈ時，提取率隨著時間的延長緩慢下降（圖２），可能是因為接骨木葉中的多糖充分溶出之后，再增加提取時間會導(dǎo)致溶液中的多糖降解，從而使提取率下降。

２．１．３料水質(zhì)量比對接骨木葉粗多糖提取率的影響接骨木葉粗多糖的提取率先隨溶劑水用量的增加而增加（圖３），在料水質(zhì)量比為１∶２５時粗多糖提取率達到最大，此時大部分多糖已溶出，再增加水的用量，多糖提取率增加不明顯，甚至有所降低，且不利于后續(xù)試驗操作。

２．１．４乙醇體積分?jǐn)?shù)對接骨木葉粗多糖提取率的影響醇沉?xí)r使用的乙醇體積分?jǐn)?shù)對粗多糖提取率有較大影響（圖４）。粗多糖提取率先隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而升高，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為８０％時粗多糖提取率最高。乙醇體積分?jǐn)?shù)為９０％時粗多糖提取率反而有所降低。其原因可能是較高的乙醇溶液濃度有利于多糖的沉淀，但濃度過高會導(dǎo)致部分多糖分子與醇溶蛋白相結(jié)合，從而溶于乙醇溶液中，不被沉淀，同時一些醇溶性雜質(zhì)、親脂性強的成分溶出量增加，共同導(dǎo)致了粗多糖提取率的降低。

２．２正交試驗結(jié)果

根據(jù)正交試驗結(jié)果（表２），各因素對接骨木葉粗多糖提取率的影響順序為提取溫度、提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料水質(zhì)量比，提取率最高的試驗組合為Ａ１Ｂ３Ｃ２Ｄ２，即提取溫度７５ ℃、料水質(zhì)量比１∶３０，提取時間３ ｈ、乙醇體積分?jǐn)?shù)８０％，在此條件下進行驗證試驗，所得多糖提取率為１５．５２％，高于正交試驗組合，說明正交試驗結(jié)果是可靠的。

３結(jié)論

以粉碎脫脂后的接骨木葉為原料，以水為溶劑提取粗多糖，設(shè)置單因素試驗和正交試驗優(yōu)化提取工藝，結(jié)果表明，在提取溫度７５ ℃、提取時間３ ｈ、料水質(zhì)量比１∶３０、乙醇體積分?jǐn)?shù)８０％的條件下，提取接骨木葉粗多糖，提取率可達１５．５２％。

參考文獻：

［１］ 孫華，王桂清． 珍貴觀賞樹種接骨木的研究現(xiàn)狀與展望［Ｊ］． 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，２０１０，４９（３）：７２７－７３０．

［２］ 徐亮，陳功錫，張代貴，等． 接骨木屬植物研究進展［Ｊ］． 中國野生植物資源，２０１０，２９（５）：１－５．

［３］ 韓華，閆雪瑩，匡海學(xué)，等． 接骨木的研究進展［Ｊ］． 中醫(yī)藥信息，２００８，２５（６）：１４－１６．

［４］ 戴啟銀． 接骨木的經(jīng)濟價值及栽培技術(shù)［Ｊ］． 林業(yè)實用技術(shù)，２００６（４）：５０－５１．

［５］ 曹夢曄，高昂，鞏江，等． 接骨木屬植物藥用研究概況［Ｊ］． 寧夏農(nóng)林科技，２０１１，５２（４）：５９－６０．

［６］ 廖瓊峰，畢開順． 接骨木屬植物的化學(xué)成分和藥理活性研究進展［Ｊ］． 中國中藥雜志，２００４，２９（２）：１０９－１１１．

［７］ 董培良，閆雪瑩，匡海學(xué)，等． 接骨木根皮抗炎鎮(zhèn)痛作用的實驗研究［Ｊ］． 中醫(yī)藥學(xué)報，２００８，３６（５）：１８－２０．

［８］ 吳志誠． 接骨木多糖提取工藝優(yōu)化及其純化研究［Ｄ］． 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，２００５．

［９］ 孫華，張濤，王桂清． 接骨木提取物有效成分含量與抑菌活性的關(guān)系［Ｊ］． 聊城大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），２０１１，２４（３）：３９－４２．

［１０］ 宋琳亮，傅江南． 接骨木多糖對大鼠胰島細胞增殖及胰島素分泌的影響［Ｊ］． 中國藥理學(xué)通報，２０１１，２７（１１）：1593-1596.

［１１］ 鄭寶華． 南方紅豆杉葉中活性多糖提取與純化研究［Ｄ］． 杭州：浙江大學(xué)，２００６．

［１２］ 陳惠黎，王克夷． 糖復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與功能［Ｍ］． 上海：上海醫(yī)科大學(xué)出版社，１９９７．

［１３］ 張桂青． 菊花多糖提取分離及初步純化研究［Ｄ］．合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，２００６．

［１４］ 劉素強，鐘應(yīng)富，吳全，等． 茶多糖的研究及其利用［Ｊ］． 南方農(nóng)業(yè)，２００９，３（５）：１１１－１１３．

［１５］ 翟樹平．刺五加、滑菇多糖提取工藝的優(yōu)化與建立［Ｄ］．石家莊：河北師范大學(xué)，２００７．