劉瑩,趙杰

摘要：用微波萃取法對褐蘑菇（Portobello mushroom）進行多糖提取并進一步純化，觀察了褐蘑菇純化多糖的基礎物理性質(zhì)并測定了褐蘑菇多糖的水分、灰分、蛋白質(zhì)及多糖含量；通過硫酸－咔唑反應、菲林試劑反應、碘－碘化鉀反應等進行了理化性質(zhì)的初步研究。結(jié)果表明，褐蘑菇純化多糖的水分含量為１．１０％，灰分含量為１．３１％，多糖含量為７３．９0％，蛋白質(zhì)含量為１．２５％、無糖醛酸、還原糖和淀粉。

關鍵詞：褐蘑菇（Portobello mushroom）；多糖；提??；理化性質(zhì)

中圖分類號：Ｓ６４６．１＋１；ＴＱ９１４．１文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）05－0981-02

Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｐｈｙｓｉcochemical Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｆｒｏｍ Ｐｏｒｔｏｂｅｌｌｏ Ｍｕｓｈｒｏｏｍ

ＬＩＵ Ｙｉｎｇ，ＺＨＡＯ Ｊｉｅ

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ of Biology， Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｆｕｘｉｎ １２３０００， Ｌｉａｏｎｉｎｇ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Microwave extraction method ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｆｒｏｍ pｏｒｔｏｂｅｌｌｏ ｍｕｓｈｒｏｏｍ ａｎｄ ｆｕｒｔｈｅｒ ｐｕｒｉｆｉｅｄ． Ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｍｏｉｓｔｕｒｅ， ａｓｈ， ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｉｅｄ pｏｒｔｏｂｅｌｌｏ ｍｕｓｈｒｏｏｍ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ． Ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ sulfate-carbazde reaction， fｅｈｌｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ ｒｅａｃｔｉｏｎ， iodine-potassium reaction． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗed ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ were １．１０％ ｗａｔｅｒ， １．３１％ ａｓｈ， ７３．９0％ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ａｎｄ １．２５％ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ pｏｒｔｏｂｅｌｌｏ ｍｕｓｈｒｏｏｍ， ｎｏ ｉｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ， ｓｕｇａｒ ａｎｄ ｓｔａｒｃｈ ｈａd been ｄｅｔｅｃｔｅｄ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐｏｒｔｏｂｅｌｌｏ ｍｕｓｈｒｏｏｍ； ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ； extract； physicochemical ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ

多糖理化性質(zhì)與其生物活性緊密相關，結(jié)構(gòu)決定理化性質(zhì)，從而影響其活性［１］。褐蘑菇（Portobello mushroom）是雙孢蘑菇的近緣種，是歐美市場最暢銷的食用菌名貴品種之一，其特點是菌蓋豐滿，肉質(zhì)感強，被譽為“素牛排”。本試驗用微波萃取法對褐蘑菇進行多糖提取并進一步純化，然后對褐蘑菇多糖進行了水分、灰分、多糖及蛋白質(zhì)含量的測定，通過硫酸-咔唑反應、菲林試劑反應、碘－碘化鉀反應等進行了理化性質(zhì)的初步研究，為進一步研究褐蘑菇純化多糖的藥理作用提供了理論依據(jù)，從而為開發(fā)褐蘑菇多糖保健品打下基礎。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１試驗材料及試劑褐蘑菇由遼寧田園實業(yè)有限公司提供。乙醇、氫氧化鈉、濃硫酸、氯仿、正丁醇、乙醚、苯酚、木瓜蛋白酶、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍Ｇ－２５０、咔唑、酒石酸鉀鈉、碘、碘化鉀等試劑購自沈陽國藥集團。

１．１．２儀器與設備Ｌ－５５０臺式低速離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；ＲＥ－５２Ａ旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；電熱恒溫真空干燥箱（上海南匯老港五金機械廠）；馬弗爐（溫州甌海自動化儀表廠）；７２４－１型可見光分光光度計（上海光學儀器五廠）。

１．２方法

１．２．１褐蘑菇多糖的提取及含量測定將褐蘑菇放入真空干燥箱５０～６０ ℃烘干至恒重，粉碎后過５０目篩，用微波萃取法［２］提取褐蘑菇多糖。經(jīng)雙氧水脫色、Ｓｅｖａｇｅ法脫蛋白得褐蘑菇純化多糖。

采用苯酚－硫酸法［3］測定多糖含量。標準曲線的制作：準確稱取１０５ ℃干燥至恒重的葡萄糖標準品２０ ｍｇ，將其定容于５００ ｍＬ容量瓶中；準確吸取標準溶液０、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０ ｍＬ，用蒸餾水補至１．０ ｍＬ，加入５％苯酚０．６ ｍＬ，再加入濃硫酸３．６ ｍＬ，混勻后于沸水浴中加熱３０ ｍｉｎ，冷卻后在４９０ ｎｍ處測定吸光度值。以吸光度值為橫坐標、葡萄糖質(zhì)量濃度為縱坐標制作標準曲線，得回歸方程ｙ＝１１．６７５ｘ－０．０３７（ｒ＝０．９９８ ７）。將提取的褐蘑菇多糖按照上述方法測吸光度值，根據(jù)回歸方程計算葡萄糖含量，再換算成多糖含量。

１．２．２褐蘑菇多糖的理化性質(zhì)

１）基礎物理性質(zhì)。提取的褐蘑菇粗多糖經(jīng)純化后，觀察其顏色、狀態(tài)、氣味，取等量褐蘑菇純化多糖分別溶于水、乙醇、乙醚、丙酮，觀察溶解情況；取一定量褐蘑菇純化多糖水溶液測定ｐＨ值。

２）水分和灰分含量的測定［4］。１００ ℃下常壓烘干，稱量，測定褐蘑菇純化多糖的水分含量；灰分含量的測定采用馬弗爐灼燒法。

３）蛋白質(zhì)含量的測定。采用考馬斯亮藍法［５］測定蛋白質(zhì)含量。稱取１００ ｍｇ考馬斯亮藍Ｇ－２５０溶于５０ ｍＬ乙醇（體積分數(shù)為９５％）中，加入１００ ｍＬ濃磷酸（體積分數(shù)為８５％），最后加蒸餾水至１ ０００ ｍＬ；稱取１０ ｍｇ牛血清白蛋白溶于１００ ｍＬ蒸餾水中，制成100 μｇ／mＬ的貯備液，再按一定比例配制成每毫升分別含２０、４０、６０、８０、１００ μｇ的蛋白質(zhì)標準溶液。分別準確吸?。保?ｍＬ各濃度標準溶液置于具塞刻度試管中，加入５．０ ｍＬ上述考馬斯亮藍Ｇ－２５０蛋白試劑，混勻，空白以蒸餾水代替，靜置２ ｍｉｎ后在５９５ ｎｍ處測吸光度值。以吸光度值為縱坐標、蛋白質(zhì)含量為橫坐標制作標準曲線，得回歸方程為ｙ＝７．４00ｘ＋０．５１６（ｒ＝０．９９７ １）。按上述方法測定褐蘑菇多糖的蛋白質(zhì)含量。

４）硫酸－咔唑反應。糖醛酸與咔唑反應生成紫紅色化合物，用硫酸－咔唑反應可以鑒別有無糖醛酸。①試劑配制。稱取咔唑０．１２５ ｇ溶于 １００ ｍＬ乙醇（體積分數(shù)為９５％）中，置于棕色試劑瓶中４ ℃保存。②測量步驟如下：將含有１０～４０ μｇ褐蘑菇純化多糖的水溶液２ ｍＬ緩慢加入盛有１２ ｍＬ濃硫酸的大試管中，置冰水浴中冷卻，然后在沸水浴中加熱１０ ｍｉｎ，冷卻至室溫，加入上述咔唑乙醇溶液０．４ ｍＬ，充分混勻，室溫下放置３０ ｍｉｎ，觀察有無紫紅色化合物生成。

５）菲林試劑反應。菲林試劑反應常用來檢測還原糖，由于還原糖中的還原性醛基可以將菲林試劑中的Ｃｕ２＋還原成Ｃｕ＋，從而生成紅色沉淀。①菲林試劑的配制。試劑甲：稱?。茫酰樱希础ぃ担龋玻?３４．５ ｇ溶于蒸餾水并稀釋至５００ ｍＬ。試劑乙：稱取氫氧化鈉１２５ ｇ、酒石酸鉀鈉１３７ ｇ溶于蒸餾水并稀釋至５００ ｍＬ。②測量步驟如下：分別取試劑甲和試劑乙各２ ｍＬ，混勻，加入含有１０～３０ ｍｇ褐蘑菇純化多糖的水溶液1 ｍＬ，搖勻，沸水浴中加熱１０ ｍｉｎ，觀察有無紅色沉淀生成。

６）碘－碘化鉀反應。先配制２％碘化鉀溶液，然后加入適量碘，使溶液呈淡棕黃色；取少量純化多糖于點滴板上，加３～５滴稀碘液，觀察顏色變化。

７）褐蘑菇多糖熱穩(wěn)定性的測定。稱?。捣荩玻?ｍｇ褐蘑菇純化多糖，加沸蒸餾水1 ｍＬ溶解后，分別置于室溫下及在４０、６０、８０、１００ ℃下烘干，觀察其顏色變化情況，然后分別用１０ ｍＬ蒸餾水溶解，３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，取上清液并定容至１０ ｍＬ，用苯酚－硫酸法［3］測定多糖含量。

２結(jié)果與分析

２．１褐蘑菇多糖的基礎物理性質(zhì)

褐蘑菇粗多糖為深褐色，粉末狀。經(jīng)脫色、脫蛋白、干燥處理得褐蘑菇純化多糖為白色，粉末狀，較易溶于水，但難溶于乙醇、乙醚、丙酮，其水溶液ｐＨ近中性。

２．２褐蘑菇多糖的水分、灰分、蛋白質(zhì)及多糖含量

褐蘑菇純化多糖的水分含量為１．１０％，灰分含量為１．３１％，蛋白質(zhì)含量為１．２５％，多糖含量為７３．９0％。

２．３化學性質(zhì)

硫酸－咔唑反應呈陰性，無紫紅色化合物生成，表明褐蘑菇多糖中無糖醛酸；菲林試劑反應呈陰性，無紅色沉淀生成，表明褐蘑菇多糖中無還原糖；碘－碘化鉀反應呈陰性，表明無淀粉。

２．４褐蘑菇多糖的熱穩(wěn)定性

在相同烘干時間條件下，以室溫放置的樣品為對照，比較不同烘干溫度的樣品顏色變化以及多糖含量。結(jié)果表明，不同烘干溫度下的樣品顏色與室溫時相同，在室溫及４０、６０、８０、１００ ℃下，褐蘑菇多糖的吸光度值分別為０．９５３、０．９３１、０．９２２、０．９１０、０．８３２，多糖的吸光度隨溫度的升高略有下降，表明溫度對褐蘑菇多糖的穩(wěn)定性有一定影響。

３結(jié)論

１）用微波萃取法提取褐蘑菇粗多糖，后經(jīng)雙氧水脫色、Sｅｖａｇｅ法脫蛋白得褐蘑菇純化多糖。褐蘑菇純化多糖為白色，粉末狀，較易溶于水，難溶于乙醇、乙醚、丙酮等有機溶劑，其水溶液pＨ近中性。褐蘑菇純化多糖的水分含量為１．１０％，灰分含量為１．３１％。

２）用苯酚－硫酸法測得褐蘑菇純化多糖中多糖含量為７３．９0％，用考馬斯亮藍法測得褐蘑菇多糖中蛋白質(zhì)含量為１．２５％。

３）硫酸－咔唑反應呈陰性，表明無糖醛酸；菲林試劑反應呈陰性，表明無還原糖；碘－碘化鉀反應呈陰性，表明無淀粉存在。溫度對褐蘑菇多糖的穩(wěn)定性有一定影響。

多糖的活性與其結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)密切相關，并且這兩個因素不是單一地影響多糖的活性，空間結(jié)構(gòu)決定理化性質(zhì)，進而影響其活性。因此，在研究多糖構(gòu)效關系時，不僅要考察各級結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)分別對多糖活性的影響，還要研究二者交互作用對多糖活性產(chǎn)生的綜合影響。本試驗對褐蘑菇多糖的理化性質(zhì)進行了初步研究，為褐蘑菇多糖的活性研究和深加工利用奠定了基礎，關于褐蘑菇多糖的構(gòu)效關系還有待進一步研究。

參考文獻：

［１］ 張琳華． 桑葉多糖提取分離純化工藝的研究及其結(jié)構(gòu)性質(zhì)的初探［Ｄ］． 天津：天津大學，２００５．

［２］ 趙富寶，劉瑩． 微波萃取褐蘑菇多糖的研究［Ｊ］．浙江食用菌，２００８，１６（６）：１７－１９．

［3］ 李娜． 褐蘑菇多糖提取及含量的測定［Ｊ］． 光譜實驗室，２００９， ２６（１）：４３－４６．

［4］ 劉瑩． 褐菇營養(yǎng)成分分析及玉米秸桿培養(yǎng)料研究［Ｄ］．長春：東北師范大學，２００７．

［５］ 李艷紅． 山楂多糖的提取、分離純化及結(jié)構(gòu)研究［Ｄ］． 太原：山西大學，２００６．