魏翠蘭　袁瓊嘉

摘要:目的:建立SD大鼠運(yùn)動(dòng)預(yù)處理模型和一次性力竭運(yùn)動(dòng)模型,通過觀察大鼠大腦皮質(zhì)微結(jié)構(gòu)、超微結(jié)構(gòu)的變化以及指標(biāo)測試,探討運(yùn)動(dòng)預(yù)處理對一次性力竭后大腦皮質(zhì)缺血再灌注的保護(hù)機(jī)制,為科學(xué)地進(jìn)行運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練提供神經(jīng)生物學(xué)參考依據(jù)。方法:選用雄性4月齡SD大鼠70只,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為:空白對照組(C組),一次性力竭組(E組)和運(yùn)動(dòng)預(yù)處理組(EP組),C組、E組大鼠常規(guī)喂養(yǎng)6周,EP組采用間歇訓(xùn)練法運(yùn)動(dòng)預(yù)處理6周。6周后除C組外,其余組大鼠采用一次性力竭訓(xùn)練,并分別在即刻、24小時(shí)、48小時(shí)取材。測定大鼠腦組織SOD、GSH-PX、MDA;制作切片觀察不同時(shí)間各組腦組織微結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果:①自由基檢測結(jié)果:各時(shí)相點(diǎn)大鼠腦組織EP組SOD,GSH-PX活性均顯著性高于C組和E組(P<0.05);其中EP組在即刻較其它組出現(xiàn)非常顯著性(P<0.01),而在第2個(gè)時(shí)相點(diǎn)E組和EP組均出現(xiàn)非常顯著性下降(P<0.01),在第3個(gè)時(shí)相點(diǎn)出現(xiàn)顯著性上升(P<0.05);E組和EP組之間MDA含量沒有顯著性差(P>0.05),但是E組MDA含量卻高于EP組②大鼠大腦皮質(zhì)微結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)結(jié)果:EP組各時(shí)相點(diǎn)神經(jīng)元細(xì)胞核損傷、線粒體損傷均明顯好于E組。結(jié)論:運(yùn)動(dòng)預(yù)處理可提高力竭運(yùn)動(dòng)后大腦組織SOD、GSH- PX活性,減輕脂質(zhì)過氧化程度,提高大腦清除自由基能力,從而有效預(yù)防一次性力竭運(yùn)動(dòng)造成的腦缺血再灌注損傷,起到對機(jī)體的內(nèi)源性保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞:大腦皮質(zhì);力竭運(yùn)動(dòng);自由基;超微結(jié)構(gòu);運(yùn)動(dòng)預(yù)處理

中圖分類號:G804.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1006-2076(2012)05-0055-07

在力竭運(yùn)動(dòng)時(shí),腦代謝的速率增加,而血供一時(shí)得不到滿足,這就造成了腦的局部缺血缺氧,此后機(jī)體經(jīng)過短時(shí)間的調(diào)整,對腦組織的供血增加,這相當(dāng)于一個(gè)再灌注過程。這相當(dāng)于以運(yùn)動(dòng)作為預(yù)處理方式,與經(jīng)典的缺血預(yù)處理極為相似。目前,運(yùn)動(dòng)預(yù)處理實(shí)驗(yàn)研究是當(dāng)前體育科學(xué)研究中的重要課題,但是現(xiàn)有的研究成果大部分都集中于心肌、骨骼肌,而對于大腦皮質(zhì)缺血再灌注損傷的干預(yù)研究則不多見。

因此本實(shí)驗(yàn)在前人的研究基礎(chǔ)上構(gòu)建“一次性力竭運(yùn)動(dòng)”和“運(yùn)動(dòng)預(yù)處理”模型,觀察大鼠腦組織自由基代謝的動(dòng)態(tài)變化和微結(jié)構(gòu)、超微結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化,探討運(yùn)動(dòng)預(yù)處理對力竭運(yùn)動(dòng)后自由基代謝的影響,以及運(yùn)動(dòng)預(yù)處理對缺血再灌注損傷保護(hù)的可能機(jī)制,為運(yùn)動(dòng)性中樞疲勞的研究提供客觀依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象

其余各組大鼠最后一次訓(xùn)練后,在相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)按上述方法進(jìn)行取材。

1.3.2 大腦皮質(zhì)組織勻漿制備

各組其余8只大鼠,用同樣的方法快速將大腦皮質(zhì)取出,制備組織勻漿,取上清液,以備檢測總SOD,MDA,GSH-PX和組織腦蛋白含量。上述操作都控制在冰水混合物上操作,檢測樣本均貯存于-70℃冰箱中。

試劑和材料:自由基相關(guān)數(shù)據(jù)采用南京建成生物工程研究所試劑盒,并嚴(yán)格按照試劑盒要求進(jìn)行操作,指標(biāo)測試在四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室完成,測試儀為biotek uquant gene company limited 酶標(biāo)儀。

1.4 數(shù)據(jù)處理

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與討論

3.1 自由基測試結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果顯示:E1組、E3組、IEP1組、IEP3組大鼠大腦皮質(zhì)MDA含量較C組都有非常顯著性升高,而一次性力竭組和預(yù)處理組之間MDA含量沒有顯著性差異(P>0.05),提示一次性力竭運(yùn)動(dòng)均會(huì)造成腦自由基堆積。在即刻自由基損傷最為嚴(yán)重,48小時(shí)有一定程度的恢復(fù),表明這種損傷是可逆的。此外SOD、GSH-PX活性IEP1組呈非常顯著性上升(P<0.01),而E1組無顯著性變化(P>0.05);在24 h都呈非常顯著性下降趨勢(P<0.01),在48小時(shí)都有所回升,在這個(gè)階段以GSH-PX上升為主。較E組各時(shí)段SOD、GSH-PX活性,IEP組均明顯高于E組,說明間歇訓(xùn)練可以有效的提高腦組織清除自由基能力。

本實(shí)驗(yàn)選擇間歇訓(xùn)練作為預(yù)處理方式,訓(xùn)練時(shí)大鼠負(fù)重為自身體重的6%,依照McArdle的方法推算,其需氧量可增至安靜時(shí)的4~5倍以上,屬于高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練[1]。由于強(qiáng)度較大,訓(xùn)練時(shí)機(jī)體可以形成短暫的缺血缺氧,休息時(shí)出現(xiàn)短暫的再灌注現(xiàn)象。從大鼠在水中掙扎情況來看,此次實(shí)驗(yàn)強(qiáng)度已達(dá)到高強(qiáng)度要求,且大鼠通過一段時(shí)間的適應(yīng)也可完成訓(xùn)練計(jì)劃。通過體重監(jiān)測IEP組大鼠體重較E組、C組無顯著性差異。此外,平時(shí)訓(xùn)練過程中通過觀察,發(fā)現(xiàn)IEP組大鼠進(jìn)食、排便情況較E組大鼠更為良好,IEP組大鼠除在第一周適應(yīng)性游泳時(shí)偶爾出現(xiàn)焦躁、亂竄外,此后幾周訓(xùn)練都顯得較為輕松,出水后都能通過大幅度抖動(dòng)來甩干體毛,所以,此次實(shí)驗(yàn)預(yù)處理組所采用的訓(xùn)練模式并未對機(jī)體造成疲勞堆積。

3.2 大腦皮質(zhì)微結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化

腦作為人體最高調(diào)節(jié)中樞,其微循環(huán)是保證腦完成其調(diào)節(jié)功能的重要保障。因此本次實(shí)驗(yàn)選擇大鼠最高調(diào)節(jié)中樞大腦作為觀察對象,對其微結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行跟蹤觀察發(fā)現(xiàn):1)E1組大鼠微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果:細(xì)胞形態(tài)完整,細(xì)胞間質(zhì)均勻致密,可辨認(rèn)出細(xì)胞核;E2組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂,多數(shù)細(xì)胞間質(zhì)疏松,血管擴(kuò)張明顯,顯示腦內(nèi)出現(xiàn)水腫。E3組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞間質(zhì)疏松,神經(jīng)纖維間隙增大,顯示腦內(nèi)有水腫,但是較24 h微結(jié)構(gòu)已有明顯好轉(zhuǎn)。2)超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果:E1組核膜內(nèi)陷,溶酶體數(shù)量增加線粒體輕微腫脹;E2組胞漿變空,核膜不完整,染色質(zhì)邊聚明顯;E3組核膜,核仁內(nèi)陷,核內(nèi)出現(xiàn)假包含體,染色質(zhì)邊聚,胞漿內(nèi)有空泡但是較24 h有明顯好轉(zhuǎn)。腦微循環(huán)改變將嚴(yán)重影響到腦的功能[3]。在試驗(yàn)中,我們可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)腦的微結(jié)構(gòu)損傷時(shí),相應(yīng)時(shí)間段的大腦皮質(zhì)MDA含量也呈上升趨勢,提示:結(jié)構(gòu)的損傷與MDA堆積呈正相關(guān)。

運(yùn)動(dòng)預(yù)處理組微結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)改變結(jié)果:1)IEP1組大鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞形態(tài)完整,細(xì)胞間質(zhì)均勻致密,可辨認(rèn)出細(xì)胞核; IEP2組細(xì)胞形態(tài)完整,細(xì)胞間質(zhì)均勻致密,細(xì)胞核清晰可見;IEP3組雖有部分細(xì)胞間見到小空泡但是仍屬正常。比較E組微結(jié)構(gòu)改變,一次性力竭對于IEP組造成的損傷顯然小得多。2)超微結(jié)構(gòu)結(jié)果:IEP1組線粒體輕微腫脹,染色質(zhì)輕微邊聚,但是較C組變化不大,IEP2組核膜內(nèi)陷,線粒體腫脹提示這一時(shí)期腦內(nèi)可能出現(xiàn)水腫,但是較E2組損傷程度較小。IEP3組大腦皮質(zhì)線粒體輕微腫脹,血管內(nèi)皮細(xì)胞凹陷,但較正常組并無太大區(qū)別,說明機(jī)體形態(tài)結(jié)構(gòu)上已基本恢復(fù)。通過大腦皮質(zhì)形態(tài)結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)改變,可以說明:間歇訓(xùn)練作為運(yùn)動(dòng)預(yù)處理方式可以有效的減輕一次性力竭運(yùn)動(dòng)對大腦皮質(zhì)的損傷。

3.3 間歇訓(xùn)練對大腦皮質(zhì)缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)的可能機(jī)制

3.3.1 保證線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性

彭峰林對間歇性低氧訓(xùn)練后大鼠心肌結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)間歇低氧適應(yīng)后能夠減輕因低氧引起的心肌線粒體腫脹、線粒體嵴斷裂消失,較好的維持線粒體等的正常形態(tài)和結(jié)構(gòu)[4]。本次實(shí)驗(yàn)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)過預(yù)處理訓(xùn)練后的大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞線粒體在遭受缺血再灌注損傷時(shí)期形態(tài)結(jié)構(gòu)較E組更為完整,特別是在力竭運(yùn)動(dòng)后24 h,其差異最為明顯。所以推測IEP組大鼠經(jīng)過6周間歇訓(xùn)練刺激,機(jī)體已經(jīng)對短暫的缺血缺氧產(chǎn)生了適應(yīng)性,因此,腦結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)IEP1組與C組并無顯著差異。24 h時(shí)機(jī)體遭受再灌注損傷,但是由于之前反復(fù)的低氧刺激,IEP2組損傷程度較E2組明顯減輕,這可能也是因?yàn)镮EP組線粒體結(jié)構(gòu)更為完整,使機(jī)體能量供應(yīng)不至于出現(xiàn)代謝障礙,從而機(jī)體可以更快更好的清除活性氧,對機(jī)體起到保護(hù)作用。

3.3.2 增強(qiáng)機(jī)體清除自由基能力

本實(shí)驗(yàn)為大強(qiáng)度間歇訓(xùn)練,每一次訓(xùn)練機(jī)體都處于較強(qiáng)的氧化應(yīng)激態(tài)中,氧自由基的增加可以通過分子機(jī)制誘導(dǎo)抗氧化酶發(fā)生適應(yīng)性變化,長期間歇訓(xùn)練,機(jī)體處于脈沖式的氧化應(yīng)激狀態(tài)中,并通過這種遺傳程序誘導(dǎo)增強(qiáng)抗氧化酶的表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)與有毒的自由基相對抗,對機(jī)體進(jìn)行自我保護(hù)。也可能是因?yàn)闄C(jī)體在長期的大強(qiáng)度間歇訓(xùn)練中機(jī)體產(chǎn)生了低濃度的自由基堆積,進(jìn)而更大程度地激活了機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的活力。這也可能是本次實(shí)驗(yàn)觀察到48小時(shí)時(shí)機(jī)體SOD、GSH-PX仍升高的可能機(jī)制。以前也有實(shí)驗(yàn)證明低水平的自由基可以促進(jìn)SOD、GSH-PX等的合成[5]。

3.3.3 增加腦血管微循環(huán)能力

彭峰林對間歇性低氧訓(xùn)練后大鼠心肌毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)間歇運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后,毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)完整,內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)小泡有所增加,細(xì)胞連接無松弛基底膜完整,可見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器。提示間歇低氧和運(yùn)動(dòng)適應(yīng)能使毛細(xì)血管密度增加,表明氧運(yùn)輸能力提高了[6]微循環(huán)的正常進(jìn)行對于大腦皮質(zhì)抗擊缺血再灌注損傷有著非常重要的意義,通過大腦皮質(zhì)形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察可以發(fā)現(xiàn)IEP各組腦血管損傷均較E組有非常顯著性減輕。這是因?yàn)榻?jīng)過長期的運(yùn)動(dòng)預(yù)處理,使得大腦皮質(zhì)毛細(xì)血管產(chǎn)生了適應(yīng)性改變,增加了其獲取氧的能力。說明運(yùn)動(dòng)預(yù)處理對機(jī)體攝氧能力的提高不僅僅存在于心肌,在腦內(nèi)也有同樣的適應(yīng)性改變。

4 結(jié)論與建議

4.1 高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練作為預(yù)處理方式可以有效的保護(hù)大腦免受缺血再灌注損傷。

4.2 一次性力竭運(yùn)動(dòng)造成的缺血再灌注損傷是可逆的,這種損傷恢復(fù)一般要持續(xù)到一次性力竭訓(xùn)練后48小時(shí)之后。

參考文獻(xiàn):

[1]鄭兵,蘇全生,熊若虹,等.間歇訓(xùn)練對負(fù)荷游泳力竭運(yùn)動(dòng)后即刻及恢復(fù)期大鼠心肌脂質(zhì)過氧化及鈣離子代謝的影響[J].成都體育學(xué)院學(xué)報(bào), 2007, 33(5): 92-95.

[2]張梅, 何葉.不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對大鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響[J].天津體育學(xué)院學(xué)報(bào),2006,21(6):151-153.

[3]袁瓊嘉,熊若虹,蘇全生,等.力竭游泳后大鼠大腦微循環(huán)超微結(jié)構(gòu)與自由基代謝動(dòng)態(tài)變化的同步研究[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志,2006,23(2)∶322-325.

[4]彭峰林,陳建文,鄧樹勛,等.間歇運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對心臟缺血再灌注損傷大鼠心肌抗氧化酶的影響[J].中國運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志,2008,27(1):97-99.

[5]Dempsey EC, Newton AC, Mochly-Rosen D, et al. Protein kinase C isozymes and the regulation of diverse cell responses[J]. Am J Physiol-Lung Cell Mol Physiol ,2000,279(3):L429-L438.

[6]彭峰林.間歇訓(xùn)練對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制的研究[D]//廣州:華南師范大學(xué),2007:104.