杜雪樹 戚華雄 夏明元

摘要：為辨別雜交中稻廣兩優(yōu)４７６種子真?zhèn)尾㈣b定其純度，利用農(nóng)業(yè)部《水稻品種鑒定 DNA指紋方法》（ＮＹ／Ｔ １４３３—２００７）中推薦的２４對(duì)引物進(jìn)行PCR，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)廣兩優(yōu)４７６及其親本，以及另外幾個(gè)育種常用親本材料進(jìn)行了多態(tài)性篩選，并利用篩選所得引物的SSR標(biāo)記對(duì)廣兩優(yōu)４７６進(jìn)行了種子純度分析。結(jié)果表明，這２４對(duì)引物在幾個(gè)常用親本及廣兩優(yōu)４７６間具有良好的多態(tài)性，可用于構(gòu)建廣兩優(yōu)４７６的ＤＮＡ指紋圖譜。同時(shí)，從中篩選得到標(biāo)記ＲＭ２０９和ＲＭ１７的兩對(duì)引物在廣兩優(yōu)４７６父母本間有顯著多態(tài)性，其中ＲＭ２０９的引物的PCR產(chǎn)物在２％瓊脂糖凝膠電泳條件下分辨效果最好，可用于廣兩優(yōu)４７６雜交種子的純度鑒定。２００９年冬在實(shí)驗(yàn)室使用ＲＭ２０９鑒定廣兩優(yōu)４７６雜交種子純度，結(jié)果為９８．６％，與２０１０年春在海南田間種植鑒定純度９８．３％相符。

關(guān)鍵詞：ＳＳＲ標(biāo)記；雜交水稻；廣兩優(yōu)４７６；品種鑒定；純度鑒定

中圖分類號(hào)：Ｓ５１１．３＋２；Ｓ３３９．３＋１文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）06－1254-03

The Variety and Purity Indentification of Hybrid Rice Guangliangyou 476

ＤＵ Ｘｕｅ－ｓｈｕ，ＱＩ Ｈｕａ－ｘｉｏｎｇ，ＸＩＡ Ｍｉｎｇ－ｙｕａｎ

（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｃｒｏｐｓ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｕｈａｎ ４３００６４，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： ２４ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ ｂｙ Ｃｈｉｎａ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｉｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ； ａｎｄ ｔｈｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｓｈｏｗｉｎｇ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｍｏｎｇ ｈｙｂｒｉｄ ｒｉｃｅ ｐａｒｅｎｔｓ ｏｆ Ｇｕａｎｇｌｉａｎｇｙｏｕ ４７６ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｐｏｐｕｌａｒ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｐｕｒｉｔｙ ｔｅｓｔ ｏｆ Ｇｕａｎｇｌｉａｎｇｙｏｕ ４７６ ｓｅｅｄｓ． Ｉｔ ｗａｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｗｅｒｅ ｗｉｔｈ ｇｒｅａｔ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｐａｒｅｎｔｓ ａｎｄ Ｇｕａｎｇｌｉａｎｇｙｏｕ ４７６， ｔｈｕｓ ｗｅｒｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｏｆ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｏｆ Ｇｕａｎｇｌｉａｎｇｙｏｕ ４７６． ２ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ， ＲＭ２０９ ａｎｄ ＲＭ１７， ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｒ４７６ ａｎｄ Ｇｕａｎｇｚｈａｎ６３Ｓ； ｍｏｒｅｏｖｅｒ， ｂａｎｄｓ ｏｆ ＲＭ２０９ ｗｅｒｅ ｗｅｌｌ ｄｅｐａｒｔｅｄ ｂｙ ２％ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ｍａｋｉｎｇ ｉｔ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｔｅｓｔ ｏｆ Ｇｕａｎｇｌｉａｎｇｙｏｕ ４７６ ｓｅｅｄｓ． Ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｅｓｔｅｄ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ Ｇｕａｎｇｌｉａｎｇｙｏｕ ４７６ ｈｙｂｒｉｄ ｓｅｅｄ ｉｎ ｗｉｎｔｅｒ ２００９ ｕｓｉｎｇ ＲＭ２０９ ｗａｓ ９８．６％， which was ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｆｉｌｅｄ ｔｅｓｔｅｄ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎ Ｈａｉｎａｎ ｓｐｒｉｎｇ ２０１０（９８．３％）．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒ； ｈｙｂｒｉｄ ｒｉｃｅ； Ｇｕａｎｇｌｉａｎｇｙｏｕ ４７６； variety identification； ｐｕｒｉｔｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ

獲得高純度的水稻雜交種子是充分發(fā)揮雜交稻雜種優(yōu)勢潛力的基礎(chǔ)。由于在制種過程中往往出現(xiàn)生物混雜、機(jī)械混雜等，導(dǎo)致雜交種子的純度和真實(shí)性受到影響，因此在水稻雜交種子銷售使用前，需對(duì)其純度和真實(shí)性進(jìn)行鑒定［１］。當(dāng)前鑒定種子純度的方法主要是田間形態(tài)鑒定法，此外還有種子形態(tài)鑒定法、幼苗鑒定法、葉色標(biāo)記鑒定法、同工酶電泳法、蛋白質(zhì)電泳法以及近年來逐漸開始應(yīng)用的水稻ＤＮＡ指紋圖譜鑒定技術(shù)等［２］。上述鑒定方法各有利弊。田間形態(tài)鑒定法結(jié)果較可靠，但存在鑒定周期長、費(fèi)用高，受季節(jié)限制，且鑒定結(jié)果是否可靠與鑒定人員經(jīng)驗(yàn)豐富與否相關(guān)；種子形態(tài)鑒定法、幼苗鑒定法、葉色標(biāo)記鑒定法則受限于檢測對(duì)象是否具備典型的特異性狀，適用范圍有限；同工酶電泳法、蛋白質(zhì)電泳法主要的問題是鑒定結(jié)果可靠程度不高；而ＤＮＡ指紋圖譜技術(shù)，主要是指利用包括ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＡＦＬＰ和ＳＳＲ等分子標(biāo)記技術(shù)，鑒定生物個(gè)體間是否存在內(nèi)在的差異［３］，因而鑒定結(jié)果可靠，其中ＳＳＲ為共顯性標(biāo)記，具有多態(tài)性豐富、簡便快捷、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，且鑒定時(shí)間短，費(fèi)用適中，不受環(huán)境影響等，相比較而言更適用于種子真?zhèn)魏图兌辱b定［４］。

廣兩優(yōu)４７６是湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所以廣占６３Ｓ為母本，以自主選育的抗白葉枯病和褐飛虱雙抗恢復(fù)系Ｒ４７６為父本選育的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗兩系雜交中稻品種，于２０１０年通過湖北省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定，審定編號(hào)２０１０００４。本研究擬通過篩選農(nóng)業(yè)部頒布的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《水稻品種鑒定 DNA指紋方法》（ＮＹ／Ｔ １４３３—２００７）中推薦的２４個(gè)ＳＳＲ標(biāo)記，得到廣兩優(yōu)４７６的指紋圖譜及適合用于雜交種純度鑒定的標(biāo)記。

１材料與方法

１．１材料

武育粳３號(hào)、黃華占、Ｒ８３８、Ⅱ－３２Ｂ、揚(yáng)稻６號(hào)、廣占６３Ｓ、Ｒ４７６、廣兩優(yōu)４７６以及ＩＲＢＢ２１、Ｂ５。含抗白葉枯病基因Ｘａ２１品系ＩＲＢＢ２１來自國際水稻研究所，抗褐飛虱基因Ｂｐｈ１４和Ｂｐｈ１５品系Ｂ５由武漢大學(xué)何光存教授提供，其他材料來自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所分子育種課題組。

１．２方法

１．２．１水稻ＤＮＡ的提取將種子置于發(fā)芽盒內(nèi)發(fā)芽，芽長３ ｃｍ左右時(shí)剪取葉片，參照李進(jìn)波等［５］改良的ＣＴＡＢ法提?。模危痢?/p>

１．２．２ＰＣＲ反應(yīng)體系ＰＣＲ反應(yīng)體系為１５ μＬ，含有１０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．３），５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ，１．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２，ｄＮＴＰｓ各０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ，１０ ｎｇ左右的ＤＮＡ模板，引物各０．２ μｍｏｌ／Ｌ，Ｔａｑ酶１ Ｕ。反應(yīng)程序?yàn)椋海梗?℃預(yù)變性５ ｍｉｎ；９４ ℃、３０ ｓ，55 ℃、３０ ｓ，７２ ℃、１ ｍｉｎ，35個(gè)循環(huán)；７２ ℃延伸５ ｍｉｎ，４ ℃保存。反應(yīng)在ＡＢＩ公司９７００熱循環(huán)儀中進(jìn)行。所有試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司。

１．２．３PCR產(chǎn)物的檢測PCR產(chǎn)物使用６％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，具體方法為取混合有染料指示劑的擴(kuò)增產(chǎn)物２ μＬ加樣于６％的非變性聚丙烯酰胺凝膠中，以１×ＴＢＥ作電泳緩沖液，３００ Ｖ恒壓電泳，電泳在雙板夾芯式電泳槽（北京六一儀器廠）上進(jìn)行，根據(jù)染料指示劑的位置終止電泳。電泳后快速銀染，結(jié)果拍照保存。銀染顯色參照Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ等［６］的方法略作改進(jìn)，方法如下：凝膠經(jīng)去離子水漂洗２次后在１ g/L ＡｇＮＯ３中染色５～１０ ｍｉｎ，去離子水漂洗２次后，在15 g/L ＮａＯＨ＋5 mL/L甲醛中顯色，最后用去離子水漂洗１次。對(duì)于篩選得到的在雙親之間差異較大的PCR產(chǎn)物，改用２％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

２結(jié)果與分析

２．１DNA指紋圖譜的構(gòu)建

對(duì)當(dāng)前育種工作中常用的７個(gè)親本材料使用２４對(duì)引物進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，均可以擴(kuò)增出穩(wěn)定的條帶（表1）。其中標(biāo)記ＲＭ２０８、ＲＭ２７３、ＲＭ３３６和ＲＭ７２的引物在不同親本間擴(kuò)增出的帶型最少，為２種；標(biāo)記ＲＭ２２４的引物擴(kuò)增出的帶型最多，為６種?？梢钥闯鲞@２４對(duì)引物較好地表現(xiàn)出了親本材料的遺傳多樣性。

２．２ＳＳＲ標(biāo)記的篩選結(jié)果

使用農(nóng)業(yè)部ＮＹ／Ｔ １４３３—２００７推薦的２４對(duì)引物對(duì)Ｒ４７６、廣占６３Ｓ、廣兩優(yōu)４７６和其他育種常用親本進(jìn)行了ＰＣＲ擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物使用６％非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記ＲＭ２０９和ＲＭ１７的引物在廣兩優(yōu)４７６中擴(kuò)增出的條帶都涵蓋了父本R476和母本廣占63S擴(kuò)增的條帶（圖１、圖２）。

２．３引物的PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中的電泳結(jié)果

為降低試驗(yàn)成本、縮短試驗(yàn)時(shí)間，對(duì)篩選所得引物的PCR產(chǎn)物使用２％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。其中ＲＭ２０９的引物擴(kuò)增出的雜種片段較為清晰，親本兩條帶型較為明顯，可適用于實(shí)際雜交種純度的檢測和鑒定（圖３）。圖3中第７泳道帶型表示雜交種中混雜了父本種子。

２．４廣兩優(yōu)４７６及含有相同抗病基因株系抗病基因的ＰＣＲ結(jié)果

從圖4與圖5可以看出，含有抗白葉枯病基因Ｘａ２１的兩個(gè)親本ＩＲＢＢ２１和Ｒ４７６帶型相同，含有抗褐飛虱基因Ｂｐｈ１４的兩個(gè)親本Ｂ５和Ｒ４７６帶型相同。

２．５ＳＳＲ標(biāo)記在廣兩優(yōu)４７６雜種純度鑒定的實(shí)際應(yīng)用

２００９年冬，對(duì)武漢華泰種業(yè)有限公司生產(chǎn)的廣兩優(yōu)４７６雜交種子，抽取５份樣品，每份?。玻埃傲７N子，使用ＳＳＲ標(biāo)記ＲＭ２０９進(jìn)行純度鑒定，鑒定結(jié)果是其純度為９８．６％。余下種子同時(shí)在海南冬播進(jìn)行田間純度鑒定，２０１０年春鑒定結(jié)果為９８．３％，結(jié)果基本相符，證明該標(biāo)記的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

３小結(jié)與討論

當(dāng)前分子標(biāo)記技術(shù)在雜交種子純度鑒定上的應(yīng)用越來越多。對(duì)于含有抗性或其他優(yōu)良基因的品種，通常使用檢測該基因的共顯性標(biāo)記來檢測其雜交種子的純度。若電泳圖譜顯示出雜合帶型則說明雜交種子是真實(shí)的。該方法的好處在于不需要大批量篩選引物，減少了工作量。但隨著各種抗性或其他優(yōu)良基因在育種實(shí)踐中的廣泛應(yīng)用，越來越多的不同親本含有相同的優(yōu)良基因。同時(shí)商業(yè)制種基地大多集中分布，在實(shí)際生產(chǎn)過程中可能會(huì)有含相同優(yōu)良基因的不同親本串粉，這樣通過檢測單一優(yōu)良基因的基因型就無法辨別串粉所造成的偽雜交種。而水稻ＤＮＡ指紋圖譜技術(shù)在種子鑒定上的優(yōu)點(diǎn)是標(biāo)記數(shù)量多，涵蓋整個(gè)基因組，反映的是品種間的內(nèi)在差異，避免了鑒別單一抗性或其他優(yōu)良基因的基因型無法鑒別上述雜交種子真?zhèn)蔚目赡苄?。因此，鑒定結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。本研究通過構(gòu)建廣兩優(yōu)４７６的DNA指紋圖譜，并篩選出了適合進(jìn)行純度分析的標(biāo)記，既為今后廣兩優(yōu)４７６雜交種子純度的鑒定奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為其他雜交稻品種的鑒定提供了借鑒。

ＳＳＲ標(biāo)記鑒定雜交種子純度要求簡便、快捷、成本低。本研究篩選所得ＳＳＲ標(biāo)記ＲＭ２０９的引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可用瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳２０～３０ ｍｉｎ即可得到結(jié)果，且瓊脂糖可以重復(fù)使用，不會(huì)造成樣品間干擾，降低了試驗(yàn)成本。此外，張鳳娟等［７］，王偉威等［８］和陳罡等［９］對(duì)植物ＤＮＡ的快速提取方法進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化，相對(duì)傳統(tǒng)ＣＴＡＢ法而言，雖然提取的ＤＮＡ質(zhì)量有所下降，但提取時(shí)間大大縮短，由數(shù)十小時(shí)縮短為僅２．５ ｍｉｎ，且不影響與多態(tài)性引物的結(jié)合及擴(kuò)增［１０］。上述快速ＤＮＡ提取法結(jié)合本研究中采用的分子標(biāo)記檢測方法可以大大降低試驗(yàn)成本，提高試驗(yàn)效率。

根據(jù)ＧＢ／Ｔ ３５４３．５—１９９５農(nóng)作物種子檢測規(guī)程對(duì)聚丙烯酰胺電泳法測定大麥、小麥種子純度的規(guī)定，一般每個(gè)樣品測定１００粒種子，但在兩系雜交稻種子純度的分子檢測方面還沒有相關(guān)規(guī)定。彭鎖堂等［１１］用ＳＳＲ標(biāo)記對(duì)雜交稻組合秈優(yōu)６３和兩優(yōu)培九分別用１００粒種子進(jìn)行純度鑒定，檢測結(jié)果與田間鑒定結(jié)果非常接近。蘇順宗等［１２］利用ＳＳＲ標(biāo)記對(duì)１２個(gè)雜交稻組合進(jìn)行分子標(biāo)記純度檢測，設(shè)３個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)檢測２００粒種子，鑒定結(jié)果經(jīng)過數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析后認(rèn)為重復(fù)性較好，沒有顯著差異。說明對(duì)雜交種子進(jìn)行純度鑒定，每份樣品抽樣２００粒已具有一定的代表性，每份樣品檢測２００粒種子，結(jié)果已比較可靠。

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