何偉明，高 坤，周 棟，孫 偉，盛梅笑

(江蘇省中醫(yī)院 腎內(nèi)科，江蘇 南京 210029)

腹膜透析是治療急慢性腎哀竭的主要腎臟替代治療方法。腹膜透析相關(guān)性腹膜纖維化是維持性腹膜透析患者常見的嚴(yán)重并發(fā)證，是導(dǎo)致腹膜超濾功能喪失，患者退出腹透治療的重要原因。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming growth factor beta1，TGF-β1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix metallopeptidase-9,MMP9)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP1)等因子在腹膜纖維化的形成過程中起重要的作用[1-2]。本實(shí)驗(yàn)選取不同劑量丹參干預(yù)加入脂多糖的高濃度腹透液對腹膜間皮細(xì)胞分泌TGF-β1、MMP9、TIMP1的影響，探討其可能的機(jī)制和治療價值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、分組及給藥情況 雄性SD大鼠56只，體質(zhì)量177～252 g，平均(214.34±7.17)g(由南京青龍山動物飼養(yǎng)廠提供，許可證號:SCXK-2001-0018)。所有實(shí)驗(yàn)動物作適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。將大鼠隨機(jī)分為5組。空白組正常飼育，不加用任何藥物；脂多糖組每日腹腔內(nèi)直接注射4.25%PD液20 mL，并在第3、5、7、9天按0.6 mg/(kg·d)加入腹透液中；丹參低劑量組每日腹腔內(nèi)直接注射含丹參6 mL/L 4.25%腹透液20 mL；丹參中劑量組每日腹腔內(nèi)直接注射含丹參12 mL/L 4.25%腹透液20 mL；丹參高劑量組每日腹腔內(nèi)直接注射含丹參24 mL/L 4.25%腹透液20 mL，后3組在第3、5、7、9天予脂多糖(LPS)0.6 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥及試劑 4.25%腹透液，由廣州百特醫(yī)療公司提供；丹參注射液，規(guī)格10 mL/支，江蘇高郵制藥廠提供，批號991014；脂多糖，規(guī)格10 mg/支，武漢博士德生物工程有限公司；TGFB1、MMP-9、TIMP-1由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，批號：sc-6832；IL-6由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供。RT-PCR試劑盒為PROMEGA產(chǎn)品(貨號：A3500)；dNTPs(貨號：CBF4901A)；MgCl2(貨號：AB401A)；rTaq PCR聚合酶(貨號：DR100AM)；PCR DL2000 Marker(貨號：D501A)為TAKARA產(chǎn)品；DEPC(AMRESCO分裝，E174)；Tris-base(AMRESCO分裝，D0194)等試劑為進(jìn)口分裝產(chǎn)品。

1.3 藥物配制 脂多糖生理鹽水稀釋0.6 mg/100 mL，混勻備用；丹參小劑量組：丹參注射液6 mL加入每升腹透液；丹參中劑量組：丹參注射液12 mL加入每升腹透液;丹參大劑量組：丹參注射液24 mL加入每升腹透液。

1.4 造模方法 注射針頭為帶鞘管的7號針頭，以左下腹靠近腹股溝中點(diǎn)為穿刺點(diǎn),常規(guī)碘酒消毒后，針頭與腹平面呈30～45 °夾角向右腹背部進(jìn)針。模型組:按脂多糖0.6 mg/kg體質(zhì)量分別在實(shí)驗(yàn)開始的3、5、7、9 d進(jìn)行腹腔注射。藥物組：取不同濃度丹參的腹透液20 mL腹腔注射，每日1次，同時按照脂多糖0.6 mg/kg體質(zhì)量分別在實(shí)驗(yàn)開始的3、5、7、9 d同步進(jìn)行腹腔注射。

1.5 標(biāo)本留取 5組大鼠于實(shí)驗(yàn)第28天，10%水合氯醛(35 mg/kg)肌注麻醉，左上腹壁避開注射部位取壁層腹膜組織、膈腹膜及腸系膜組織用10%中性甲醛固定，石蠟包埋用于常規(guī)、特殊染色及免疫組化檢測。

1.6 引物 根據(jù)網(wǎng)上NCBI數(shù)據(jù)庫中各自基因序列設(shè)計而獲得，序列如下，由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成:β-actin：548 bp 上游引物：5’-GTTGTCCCTGT

ATGCCTCTG-3’ 下游引物：5’-GGAGCCAGGGCAGTA

ATCT- 3’ TGF-β1：682 bp 上游引物：5’-CTTGCTGTACTGTGTGTCCAG-3’ 下游引物：5’-TAATGGTGGACCGCAACAACG-3’ MMP-9：248 bp 上游引物：5’-TTT

TGCTCGGGCCTTAAAA-3’ 下游引物：5’-CATACTTTACGCGGACCACTT-3’ TIMP-1：310 bp 上游引物：5’-GCCATGGAGAGCCTCTGTGG-3’ 下游引物：5’-GCAGGCAGGCAAAGTGATCG-3’。

1.7 大鼠腹膜組織提取總RNA及純度鑒定 每組加入2 mL trizol試劑，組織勻漿器中勻漿后，移入1.5 mL離心管中。室溫靜置5 min。4 ℃、12 000 r/min離心10 min。每管加入0.2 mL氯仿，振蕩混合液15 s，室溫放置3 min。4 ℃、12 000 r/min離心15 min。將水相轉(zhuǎn)移至一離心管內(nèi)，加入等體積異丙醇，充分混勻,-20 ℃放置1 h。4 ℃、12 000 r/min離心10 min。棄上清，加入75%乙醇1 mL，4 ℃、7 500 r/min離心5 min。超凈臺內(nèi)棄乙醇上清,自然干燥，加入無酶水，輕振蕩使溶解，離心、混勻，轉(zhuǎn)入-80 ℃保存。

總RNA純度鑒定：取出各組總RNA少量，核酸蛋白定量儀(德國EPPENDORF公司，EPPENDORF)檢測各組總RNA濃度及純度，各組總RNA純度A260/280值在1.95～2.0之間。

1.8 RT-PCR反應(yīng)

1.8.1 RT反應(yīng) 1)取0.6 mL離心管，每管內(nèi)加入隨機(jī)引物2 μL,總RNA 1.0 μg?；靹?，70 ℃孵育10 min。2)每管加樣：MgCl2(25mM)4 μL，RT 10×Buffer 2μL，dNTPs(10 mM)2 μL，RNasin Inhibiter 0.5 μL，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，加水至總體積20 μL。PCR擴(kuò)增儀(英國HYBAID公司，HYBAID EXPRESS)：42 ℃1 h；95 ℃10 min；4 ℃保存。

1.8.2 PCR反應(yīng) 1)25 μL PCR(β-actin)反應(yīng)液如下：dNTPs(10 mM)0.5 μLM，MgCl2(25 mM)2.5 μL，r Taq PCR10×Buffer 2.5 μL,上游引物P1(10 μM)1.0 μL，下游引物P2(10 μM)1.0 μL，r Taq DNA聚合酶0.3 μL，cDNA第一鏈合成液5 μL，無酶水12.2 μL，總體積25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s,30個循環(huán)；72℃ 7 min；4℃保存。2)25 μL PCR(TGF-β1)反應(yīng)液如下：dNTPs(10 mM)0.5 μL，MgCl2(25 mM)2.5 μL，r Taq PCR10×Buffer 2.5μL,上游引物P1(10 μM)1.0 μL，下游引物P2(10 μM)1.0 μL，r Taq DNA聚合酶0.3 μL cDNA第一鏈合成液5 μL，無酶水12.2 μL，總體積25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；94℃ 30s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)；72 ℃7 min；4 ℃保存。3)25 μL PCR(TIMP-1)反應(yīng)液如下：dNTPs(10 mM)0.5 μL，MgCl2(25 mM)2.5 μL,r Taq PCR10×Buffer 2.5 μL,上游引物P1(10 μM)1.0 μL，下游引物P2(10 μM)1.0 μL,r Taq DNA聚合酶0.3 μL，cDNA第一鏈合成液15 μL，總體積25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min；4 ℃保存。4)25 μL PCR(MMP-9)反應(yīng)液如下：dNTPs(10 mM)0.5 μL，MgCl2(25 mM)2.5 μL,r Taq PCR10×Buffer 2.5 μL，上游引物P1(10 μM)1.0 μL，下游引物P2(10 μM)1.0 μL，r Taq DNA聚合酶0.3 μL，cDNA第一鏈合成液15 μL，總體積25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min；4 ℃保存。

1.9 PCR產(chǎn)物電泳 1.6%瓊脂糖凝膠電泳：0.24 g瓊脂糖凝膠+30 mL 0.5×TBE，加熱溶解，加入EB，混勻后倒平板。Marker為PCR DL 2000(TAKARA產(chǎn)品)。加5.0 μL PCR擴(kuò)增液(TGF-β1加8.0 μL PCR擴(kuò)增液)電泳，80 V電泳40 min。Alpha Imager 2 000凝膠圖象系統(tǒng)(美國2000公司)對凝膠進(jìn)行拍照、光密度數(shù)據(jù)分析。

1.10 實(shí)驗(yàn)結(jié)果評估 免疫組化標(biāo)記:各組指標(biāo)均定位于細(xì)胞漿，以細(xì)胞漿著色呈棕黃色為陽性細(xì)胞，參照Watanabe等免疫組織化學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)，采用雙盲法，通過評分對它們的染色強(qiáng)度進(jìn)行分級。根據(jù)腹膜組織中間皮細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色的深淺和陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)對每個切片逐一評分，取其平均值為該片染色強(qiáng)度。

染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)<5%、未被染色為陰性(-),5%～20%、淺棕色為弱陽性(+)，21%～50%、棕色為陽性(++)，51%～75%、深棕色為陽性(+++)，>75%、棕褐色為強(qiáng)陽性(++++)。為了統(tǒng)計方便，予以半定量計分：0、1、2、3、4。分別對應(yīng)-、+、++、+++、++++。

2 結(jié)果

2.1 對腹膜組織TGF-β1表達(dá)的影響 見表1，圖1，表2，圖2。

表1 腹膜組織TGF-β1 mRNA(/β-actin)表達(dá)值±s,n=6)

表2 各組大鼠TGF-β1光密度積分結(jié)果±s,n=6)

2.2 對腹膜組織MMP-9表達(dá)的影響 見表3，圖3，表4，圖4，圖5。

表3 腹膜組織MMP-9 mRNA(/β-actin)表達(dá)值±s,n=6)

表4 MMP9光密度積分結(jié)果±s,n=6)

2.3 對腹膜組織TIMP-1表達(dá)的影響 見表5，圖6，表6，圖7。

表5 腹膜組織TIMP-1 mRNA(/β-actin)表達(dá)值±s,n=6)

表6 TIMP-1光密度積分結(jié)果±s,n=6)

3 討論

腹膜透析目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于終末期腎臟疾病的替代治療。隨著治療時間延長，腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能衰竭已成為透析技術(shù)性失敗的最重要的原因[2]。如何有效提高腹膜透析的透析效能、保護(hù)腹膜功能是當(dāng)前臨床工作者所面臨的一個重大課題。丹參主要成分為丹參酮和丹參素，是重要的活血化瘀藥物，具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)，使血流速度加快，提高跨毛細(xì)血管超濾的作用。已有動物試驗(yàn)[3]證實(shí)丹參可保護(hù)腹膜間皮層結(jié)構(gòu)的完整,拮抗Ca2+內(nèi)流,減弱淋巴管的收縮，從而減少了腹腔淋巴回流使凈超濾量增加。

TGF-β1是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的生長因子，是膠原纖維和其他細(xì)胞外成分合成和沉積的強(qiáng)有力的始動因子[1]。高滲性葡萄糖刺激腹膜間皮細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β1增加,呈劑量依賴性[3]。TGF-β1可以促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞如腹膜間皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及成骨細(xì)胞等的增殖，不僅促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分沉積,同時又抑制其降解。TGF-β1還可通過下調(diào)組織纖溶酶原激活劑(tPA)和纖溶酶原激活劑抑制劑-1(PAI-1)的比例而降低機(jī)體纖溶能力[4-5]。TGF-β1誘導(dǎo)VEGF因子產(chǎn)生，腹膜新生血管生成增加，最終導(dǎo)致腹膜纖維化的形成,腹膜失超濾[5]。因此針對TGF-β1研究成為防治腹膜纖維化的新的治療靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，丹參注射液加入腹透液中,中劑量及高劑量組均可下調(diào)TGF-β1的表達(dá)，與模型組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，從而抑制腹膜纖維化的產(chǎn)生。

MMPS及TIMPS的功能紊亂與ECM過多堆積密切相關(guān),是調(diào)節(jié)ECM動態(tài)平衡的最重要的一大酶系[6]。MMPs的主要生理性抑制劑是內(nèi)源性的TIMPS。TIMPS可與MMPs以非共價鍵形式生成1∶1復(fù)合物，對活性MMPS具有專一的抑制作用。MMPS和TIMPS活性的精確平衡對ECM成分的完整非常重要,二者之間的平衡共同實(shí)現(xiàn)著對膠原合成與降解穩(wěn)態(tài)的調(diào)控[7]。已發(fā)現(xiàn)20種MMPs,其中MMP-9又稱明膠酶B，主要降解明膠、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型膠原及層黏連蛋白、蛋白聚糖及彈性蛋白等，能降解完整的基底膜[8]，TIMP-1作為MMP-9特異性抑制物，可特異性地與相應(yīng)MMP催化活性中心的鋅離子結(jié)合封閉其催化活性,阻斷其對細(xì)胞外基質(zhì)的降解作用，引起細(xì)胞外基質(zhì)的積聚。

本研究顯示，丹參各劑量組均可上調(diào)MMP-9 mRNA的表達(dá)(P<0.05),下調(diào)TIMP-1 mRNA的表達(dá)(P<0.05)。提示丹參能抑制TGF-β1的表達(dá)，上調(diào)MMP-9，下調(diào)TIMP-1,調(diào)節(jié)MMP-9/TMIP-1之間的平衡,干預(yù)ECM的重塑從而干預(yù)腹膜纖維化。丹參注射液對大鼠腹膜纖維化比模型組顯著減輕，其機(jī)制可能通過保護(hù)腹膜間皮細(xì)胞，抗炎、抗纖維化、抗氧自由基，并具有抑制TIMP-1表達(dá)，上調(diào)MMP9的作用[9]。

1.正常組 2.模型組 3.丹參低劑量組 4.丹參中劑量組 5.丹參高劑量組

A正常組

B模型組

C丹參低劑量組

D丹參中劑量組

E丹參高劑量組

1.正常組 2.模型組 3.丹參低劑量組 4.丹參中劑量組 5.丹參高劑量組

A正常組

B模型組

C丹參低劑量組

D丹參中劑量組

E丹參高劑量組

A正常組

B模型組

C丹參低劑量組

D丹參中劑量組

E丹參高劑量組

1.正常組 2.模型組 3.丹參低劑量組 4.丹參中劑量組 5.丹參高劑量組

A正常組

B模型組

C丹參低劑量組

D丹參中劑量組

E丹參高劑量組

本研究提示丹參加入腹膜透析液中具有一定的拮抗腹膜纖維化的作用。

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