袁托亞, 劉曉宇, 王悅喜

?

新發(fā)現(xiàn)的蒙古族ABCA1M233V基因和R219K基因多態(tài)性

袁托亞, 劉曉宇*, 王悅喜

（內(nèi)蒙古醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科, 呼和浩特 010050）

探討ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子A1基因（ABCA1）M233V和R219K多態(tài)性在內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族人群中的分布及其與血脂和冠心病的關系。采用聚合酶鏈反應-限制片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）方法檢測115例蒙古族冠心病患者和對照組ABCA1基因相應片段的多態(tài)性。內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族人群中ABCA1基因M233V多態(tài)性位點存在MM, MV和VV三種基因型, 其在冠心病患者和對照組人群的基因多態(tài)性分布差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05）。MM組和MV+VV組總膽固醇（TC）, 甘油三酯（TG）, 高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）比較, 差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05）。對照組KK基因型的頻率顯著高于CHD組（＜0.05)。KK基因型的HDL-C水平顯著高于RR型（＜0.05）, KK型TG水平明顯低于RR型, 差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05)。內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族人群中存在新發(fā)現(xiàn)的ABCA1基因M233V多態(tài)性, ABCAl基因R219K多態(tài)性與內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族人群冠心病的遺傳易感性相關, KK基因型產(chǎn)生有益的臨床血脂譜, 可能是冠心病患者的低危遺傳標記。

冠心病; 三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子A1; 多態(tài)性; 蒙古族

國內(nèi)外均有研究表明, 三磷酸腺苷結(jié)合盒子轉(zhuǎn)運體1 （ATP binding cassette transporter 1,ABCA1）功能障礙可促進冠心病的發(fā)生發(fā)展。我們在中國蒙古族人中發(fā)現(xiàn)一個國內(nèi)外僅見一次報道的新單核苷酸多態(tài)性位點即M233V基因多態(tài)性位點的改變, 我們首次發(fā)現(xiàn)了VV型（GG型）基因型變異。本研究探討了中國蒙古族人ABCA1基因R219K和M233V變異位點及與血脂、冠心病的關系, 旨在為內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族冠心病的預防及治療提供進一步的理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 對象

共觀察內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族115例, 均來自2008年12月～2010年10月內(nèi)蒙古醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科住院患者。冠心病組60例, 平均年齡（58.77±9.98）歲, 行冠狀動脈造影確診（至少1支冠狀動脈直徑狹窄≥50%） 30例, 經(jīng)臨床癥狀結(jié)合心電圖、超聲心動圖、平板運動實驗、心肌灌注ECT顯像及64排冠狀動脈CT確診30例; 對照組55例, 平均年齡（55.10±11.8）歲, 經(jīng)詢問病史、體檢、實驗室檢查（血、尿、糞便常規(guī), 血脂, 血糖, 肝、腎功能）、心電圖、胸片、心臟彩超、心肌灌注ECT顯像、64排冠狀動脈CT、冠狀動脈造影等檢查排除冠心病、嚴重肝腎功能不全。排除標準: 風濕性疾病、大動脈炎、血液病、結(jié)核、腫瘤、嚴重肝腎功能不全、腦血管疾病等。

1.2 方法

1.2.1 血脂水平的檢測 所有化驗檢查均采用次日清晨空腹采取肘靜脈血3ml, 分離血清測定血脂水平, 甘油三酯（triglyceride, TG）、總膽固醇（total cholesterol, TC）以氧化酶法測定, 高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein-cholesterol, HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein- cholesterol, LDL-C）用PEG變構(gòu)酶法測定, 試劑均為Leadman公司生產(chǎn)。儀器為日本OLYMPUS AU 600全自動生化分析儀。

1.2.2 DNA提取 用EDTA抗凝真空采血管采集外周靜脈血3ml, 置于－80℃保存?zhèn)溆?。按照血?細胞/組織基因組DNA提取試劑盒的說明提取血液DNA（由TIANGEN公司提供）。

1.2.3 設計引物 設計PCR引物, R219K上游引物: 5￠-GTATTTTTGCTACCAGTTACATTTGACAA-3￠,下游引物: 5￠-GATTGGCTTCAGGATTGTTGGAA-3￠。M233V上游引物:5'GCAAGGCTACCAGTTACATT-3', 下游引物: 5'-GTCCAAGGAAAAGCCTCA-3￠, 由上海生工生物工程技術服務公司合成。

1.2.4 ABCA1基因多態(tài)片段的PCR擴增 PCR反應在PTC-200型循環(huán)儀中進行。PCR 反應體系50μl, 包括: 2×Taq PCR MasterMix（由Tiangen公司提供）25μl, DNA 2.0μl, 上游和下游引物分別1.0μl（10μmol/L）, 滅菌超純水21μl。PCR反應條件: 94℃預變性5min; 94℃變性30 s, 53℃退火30s, 72℃延伸40s, 共25個循環(huán); 72℃終末延伸5 min。

1.2.5 PCR產(chǎn)物的酶切消化Ⅰ酶切反應體系30μl, PCR產(chǎn)物10μl,Ⅰ內(nèi)切酶（由Fermantas公司提供）1.0μl, 10×NEB Buffer 2.0μl, 滅菌超純水18.0μl, 置于37℃酶切12h。取酶切產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳檢測并確定樣品基因型。DNA Marker為BioMarkerⅠ（100bp, 由BioFluk公司提供）。II酶切反應體系20μl, PCR產(chǎn)物10μl, 限制性內(nèi)切酶II（由BioLab公司提供）0.6μl, 10×NEB Buffer 2.0μl, 滅菌超純水7.4μl。置于25℃恒溫水浴箱中18h, 2%瓊脂糖凝膠驗證。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 冠心病組與對照組的一般資料和基因分布平衡檢驗

兩組研究對象一般資料見表1。對冠心病組和對照組的基因型分布進行了平衡檢驗, 結(jié)果表明, R219K基因型（冠心病組:2=0.023, df=1,＞0.05; 對照組:2=3.04, df=1,＞0.05）和M233V基因型（冠心病組:2=0.83, df=1,＞0.05; 對照組:2=1.17, df=1,＞0.05）的分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律, 具有群體代表性。

表1 冠心病組和對照組一般資料

HDL-C: 高密度脂蛋白膽固醇; LDL-C: 低密度脂蛋白膽固醇; TG: 甘油三酯; TC: 總膽固醇。與對照組比較,*＜0.05

2.2 R219K位點多態(tài)性分析

R219K 擴增產(chǎn)物片段長度為177bp, 經(jīng)Ⅰ酶切后, K等位基因被切為3個可能的基因型（圖1）。RR型: 純合子GG（177 bp）; RK型: 雜合子GA（177 bp, 107 bp, 70bp）; KK 型: 純合子AA（107bp, 70bp）。表2結(jié)果表明, 冠心病組與對照組間基因型和等位基因頻率分布比較, 冠心病組KK型分布明顯低于對照組, 差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05）, 基因型KK個體顯著減少患冠心病的危險[OR=0.411, 95%CI 0.17～0.99]。

圖1 R219K酶切(XagⅠ)產(chǎn)物

Figure 1Ⅰ digested products of R219K

M: 100bp DNA Marker; 1,4: RR基因型; 2: RK基因型; 3: KK基因型

表2 兩組ABCA1基因型和等位基因頻率分布

注: 與對照組比較,*＜0.05

2.3 M233V位點多態(tài)性分析

ABCA1基因第7號外顯子DNA序列中1092位上一個核苷酸由G→A的改變（A1092G）, 導致233位氨基酸由甲硫氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸（M233V）。ABCAl產(chǎn)物片段總長度為240bp。經(jīng)特異性限制內(nèi)切酶消化之后, 這個240 bp片段可被切割成三個可能的基因型: VV（240 bp）, MV（240bp, 146bp, 94bp）, MM（146bp, 94bp）（圖2）。冠心病組發(fā)現(xiàn)18例A1092G位點的改變, 發(fā)生率為30%, 其中17例為MV型, 1例為VV型。對照組14例改變, 全部為MV型, 發(fā)生率為25.6%。兩組人群的基因多態(tài)性分布差異無統(tǒng)計學意義。

圖2 M233V酶切(CviAⅡ)產(chǎn)物

Figure 2Ⅱ digested products of M233V

M: 100bp DNA Marker; 1: MV基因型; 2: MM基因型; 3: VV基因型

2.4 R219K和M233V各基因型血脂水平比較

M233V V等位基因攜帶者和非攜帶者間TC, TG, HDL-C, LDL-C比較, 差異無統(tǒng)計學意義（表3）。R219K ABCA1不同基因型之間血脂水平比較, KK型和RK型TG與RR型比較, 差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05）, KK型HDL-C與RR型比較, 差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05; 表4）。

表3 ABCA1 M233V V等位基因攜帶者和非攜帶者血脂比較

注: HDL-C: 高密度脂蛋白膽固醇; LDL-C: 低密度脂蛋白膽固醇; TG: 甘油三酯; TC: 總膽固醇

表4 ABCA1 R219K三種基因型血脂比較

注: TC: 總膽固醇; TG: 甘油三酯; HDL-C: 高密度脂蛋白-膽固醇; LDL-C: 低密度脂蛋白-膽固醇。與RR基因型比較,*＜0.05

3 討 論

1999年人們闡明ABCA1基因變異與丹吉爾病、家族性HDL-C缺乏的發(fā)生密切相關。ABCA1基因?qū)儆贏TP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子基因超家族中的一個亞型, ABCA1介導的細胞內(nèi)膽固醇流出, 是膽固醇逆向轉(zhuǎn)運的起始環(huán)節(jié), 機體清除組織細胞內(nèi)過多的膽固醇主要是通過膽固醇逆向轉(zhuǎn)運來實現(xiàn)的。如果ABCA1基因突變, 有可能使其編碼的氨基酸改變, 從而導致其功能發(fā)生改變, 使膽固醇外流障礙, 膽固醇和膽固醇脂在巨噬細胞內(nèi)積聚而成為泡沫細胞, 繼而浸潤血管壁, 促進動脈粥樣硬化和冠心病的發(fā)生發(fā)展。已有研究顯示, 用骨髓移植的方法使巨噬細胞過表達, ABCA1可以明顯抑制動脈粥樣硬化病變的進程[1]。在動脈壁, 增加ABCA1的表達可使巨噬細胞清除自身過多的膽固醇, 從而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用[2]。因此, ABCA1基因是調(diào)節(jié)膽固醇和磷脂代謝平衡的關鍵途徑, ABCA1與動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展密切相關。

單核苷酸多態(tài)性在人群中的發(fā)生率差異很大, 不同類型和位置的ABCA1變異, 其表現(xiàn)各異, 即使是相同或距離較近的變異, 其意義也截然不同。有些變異（如同義突變）可能沒有或很少影響到ABCA1的功能, 與血漿HDL-C水平變化無明顯相關性, 如-565 C/T, 但其T等位基因可能增加亞臨床型心血管疾病的危險性[3]。有一些變異使HDL-C增高[3-5], 具有抗動脈粥樣硬化作用和減少冠心病的危險性, 如R219K,C-105T,V771M和V825I; 有些變異使HDL-C水平下降, 增加冠心病的危險性, 如E1172D和R1587K[5]。在啟動區(qū)的核苷酸多態(tài)性與動脈粥樣硬化的嚴重程度相關, 如-191C/-320C/-477T, G191C和A-1096G加重動脈粥樣硬化, 而C17G減輕動脈粥樣硬化, 這些變異不伴有血脂水平的改變。此外, V825I, I883M, E1172D單核苷酸多態(tài)性能使臨床事件增加及動脈粥樣硬化加重[6]。

目前, 國內(nèi)外研究較多且較深入的單核苷酸多態(tài)性突變是R219K型ABCA1, 通過PCR-RFLP方法檢測內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族ABCAl R219K多態(tài)性, 證實了在內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族人群中存在ABCA1 R219K變異。冠心病組RR型頻率高于對照組[7], 但未達到統(tǒng)計學差異, 而KK型頻率低于對照組, 差異有統(tǒng)計學意義。計算KK基因型的OR值發(fā)現(xiàn)[OR= 0.411, 95%CI 0.17～0.99], 基因型KK個體顯著減少患冠心病的危險, 提示KK基因型是蒙古族冠心病發(fā)病的一個保護因子。本實驗研究表明, 內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族人群不僅KK基因型HDL-C水平明顯高于RR型, 而且其TG水平也明顯低于RR型。這說明KK型基因不僅可升高HDL-C水平[10],且亦可通過降低TG水平而發(fā)揮抗冠心病作用, 提示蒙古族ABCA1 R219K變異與血脂異常[11,12]及冠心病之間存在一定的關系。其發(fā)生機制為, HDL-C促進膽固醇外流, 抑制血脂氧化, 抑制單核細胞克隆刺激因子和單核細胞趨化蛋白-1, 促進纖維蛋白溶解, 加強前列環(huán)素的作用, 抑制血管平滑肌增生, 從而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化和冠心病的作用。

M233V是一個新發(fā)現(xiàn)的ABCA1基因單核苷酸多態(tài)性, 這種基因型改變目前國內(nèi)外僅見一篇報道[13]。此位點為ABCA1基因第7號外顯子DNA序列中1092位上一個核苷酸G→A（A1092G）的改變, 它導致ABCAl蛋白233位氨基酸由甲硫氨酸突變?yōu)槔i氨酸（M233V）。60例蒙古族冠心病患者經(jīng)Ⅱ限制性內(nèi)切酶酶切分析發(fā)現(xiàn), 18例存在A1092G改變, 17例為MV型（AG型）, 1例為VV型（GG型）, 42例MM型（AA型）, MV型發(fā)生率為28.3%, VV型發(fā)生率為1.7%, MM型發(fā)生率為70.0%。55例對照組發(fā)現(xiàn)14例A1092G改變, 14例為MV型改變, 41例為MM型, MV型發(fā)生率為25.5%, MM型發(fā)生率為74.5%, 但各基因型在兩組間發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義。兩組均為MM型分布最廣, MV型次之, VV型最少。而本研究發(fā)現(xiàn)的1例VV型（GG型）在國內(nèi)外為首次報道。此外, MM型與MV型和VV型之間的血脂改變無統(tǒng)計學差異, 說明這種新發(fā)現(xiàn)的基因型變異對冠心病和血脂的影響尚不確定?？赡芘c不同基因因素（同時存在其他基因位點的改變或調(diào)控基因的影響）、不同種族、不同民族以及生活飲食習慣和地域差異有關, 更具體機制還需要進一步的大樣本研究工作來明確。

總之, 本研究結(jié)果提示,ABCAl基因R219K多態(tài)性與內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族人群冠心病的遺傳易感性相關, 其中KK基因型是冠心病的保護因子。ABCA1基因中A219K可通過影響血液中HDL-C及TG的水平而影響冠心病的易感性,發(fā)揮對心血管的保護作用。新發(fā)現(xiàn)的ABCA1基因M233V MM型分布最廣, MV型次之, VV型最少。我們在內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族冠心病患者中首次發(fā)現(xiàn)了VV型（GG型）基因型變異, 但其對冠心病和血脂的影響尚不確定, 有待于在細胞生物表達和大樣本的研究中探討它的可能機制。

[1] Vaneck M, Singaraja RR, Ye D,. Macrophage ATP binding cassette transporter A1 overexpression inhibits atherosclerotic lesion progression in low density lipoprotein receptor knockout mice[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2006, 26 (4): 929-934.

[2] Attie AD. ABCA1: at the nexus of cholesterol, HDL and atherosclerosis[J]. Trends Biochem Sci, 2007, 32(4): 172- 179.

[3] Benton JL, Ding J, Tsai MY,. Associations between two common polymorphisms in the ABCA1 gene and subclinical atherosclerosis: Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis[J]. Atherosclerosis, 2007, 193(2): 352-360.

[4] Genvigir FD, Soares SA, Hirata MH,. Effects of ABCA1 SNPs, including the C-105T novel variant, on serum lipids of Brazilian individuals[J]. Clin Chim Acta, 2008, 389(1-2): 79-86.

[5] Slatter TL, Jones GT, Williams MJ,. Novel rare mutations and promoter haplotypes in ABCA1 contribute to low-HDL-C levels[J]. Clin Genet, 2008, 73(2): 179-184.

[6] Frikke-Schmidt R, Nordestgaard BG, Jensen GB,. Genetic variation in ABCA1 predicts ischemic heart disease in the general population[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2008, 28(1): 180-186.

[7] Doosti M, Najafi M, Reza JZ,. The role of ATP-binding-cassette-transporter-A1 (ABCA1) gene poly-mor-phism on coronary artery disease risk[J].Transl Res,2010, 155(4): 185-190.

[8] Andrikovics H, Pongrácz E, Kalina E,Decreased frequencies of ABCA1 polymorphisms R219K and V771M in Hungarian patients with cerebrovascular and cardio-vascular diseases[J]. Cerebrovasc Dis, 2006, 21(4): 254-259.

[9] 劉競麗, 李勁頻, 汪曉玲. ABCA1基因R219K多態(tài)性與青年缺血性腦卒中的相關性研究[J]. 中華神經(jīng)醫(yī)學雜志, 2009, 8(12): 1221-1225.

[10] 趙水平, 肖志杰, 聶 賽, 等. 冠心病患者ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子1基因R219K變異的研究[J].中華心血管病雜志, 2004, 32(8): 712-716.

[11] Li J, Wang LF, Li ZQ,Effect of R219K polymorphism of the ABCA1 gene on the lipid-lowering effect of pravastatin in Chinese patients with coronary heart disease[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol,2009, 36(5-6): 567-570.

[12] Kitjaroentham A, Hananantachai H, Tungtrongchitr A,. R219K polymorphism of ATP binding cassette transporter A1 related with low HDL in overweight/obese Thai males [J]. Arch Med Res, 2007, 38(8): 834-838.

[13] 郭志剛, 王琦光, 賴文巖, 等. 新發(fā)現(xiàn)的中國人ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子A1基因M233V單核苷酸多態(tài)性及其家系調(diào)查[J]. 中華心血管病雜志, 2006, 34(12): 1101-1104.

（編輯: 王雪萍）

A novel polymorphism in ABCA1 gene (M233V and R219K) in Mongolian nationality population

YUAN Tuoya, LIU Xiaoyu*, WANG Yuexi

(Department of Cardiology, First Affiliated Hospital, Inner Mongolia Medical College, Huhehot 010050, China)

To investigate ATP-binding cassette transporter 1(ABCA1) M233V and R219K gene polymorphism in Mongolian nationality population in Inner Mongolia region and its correlationship with blood lipids and coronary heart disease(CHD).The target fragments of ABCA1gene were amplified and analyzed by polymerase chain reaction-restriction fragments length polymorphism(PCR-RFLP) technique in 115 Mongolian control subjects without CHD and patients with CHD.The subjects presented ABCA1 gene M233V polymorphism, which had three genotypes: MM genotype, MV genotype and VV genotype. There was no significant difference in frequency of allele and genotype in M233V polymorphism between controls and CHD patients(＞0.05).No significant difference was found in levels of total cholesterol(TC), triglyceride(TG), high density lipoprotein-cholesterol(HDL-C) and low density lipoprotein-cholesterol(LDL-C) between MM genotype and MV+VV genotype(＞0.05).The frequency of KK genotype was significantly higher in controls than in CHD patients(＜0.05). KK genotype had higher HDL-C level(＜0.05) and lower TG level than RR genotype (＜0.05).In Mongolian population in Inner Mongolia region, M233V is a novel polymorphism in ABCAl gene. ABCAl gene R219K polymorphism is associated with CHD risk．The KK genotype results in a beneficial profile of blood lipids, which may be a novel genetic marker for low risk of CHD.

coronary heart disease; ATP binding cassette transporter 1; polymorphism; Mongolian nationality

(20080404MS1135)

R541.4

A

10.3724/SP.J.1264.2012.00026

2011-06-19;

2011-08-29

內(nèi)蒙古自然科學基金(20080404MS1135)

劉曉宇, Tel: 0471-6636692, E-mail: xxggood1@126.com