吳 暉, 謝紅梅, 劉江奎, 羅 俊, 黃澤俊, 李江寧

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急性胰腺炎時(shí)胰腺誘生型一氧化氮合酶及瘦素與腸壁通透性的關(guān)系及大黃素對(duì)其的影響

吳 暉*, 謝紅梅, 劉江奎, 羅 俊, 黃澤俊, 李江寧

（華北石油總醫(yī)院消化科, 任丘 062552）

探討大黃素在急性胰腺炎（AP）時(shí)對(duì)胰腺誘生型一氧化氮合酶（iNOS）和血清瘦素表達(dá), 以及對(duì)腸壁通透性的影響及作用機(jī)制。60只成年SD大鼠隨機(jī)分為AP組（= 20）, 假手術(shù)組（= 20）, 和大黃素組（= 20）。檢測(cè)血清淀粉酶活性、血清瘦素含量、胰腺組織中iNOS及NO含量、腸黏膜通透性（以血液與腸內(nèi)125I-清蛋白累積指數(shù)表示）, 并對(duì)胰腺和回腸進(jìn)行病理學(xué)檢查。AP組和大黃素組血清淀粉酶活性、瘦素含量、胰腺組織內(nèi)的NO和iNOS水平及125I-清蛋白累積指數(shù)均顯著高于假手術(shù)組（＜0.05）; 與AP組比較, 大黃素組血清淀粉酶活性、胰腺組織內(nèi)的NO、iNOS水平及125I-清蛋白累積指數(shù)均顯著下降（＜0.05）, 血中瘦素含量明顯升高（＜0.05）, 同時(shí)胰腺及回腸病理損害明顯減輕。AP腸壁通透性增加的原因之一可能與AP時(shí)胰腺iNOS的過度表達(dá)產(chǎn)生過多NO有關(guān), 大黃素可降低胰腺iNOS的表達(dá), 該作用可能與升高血清瘦素水平有關(guān), 大黃素對(duì)降低AP時(shí)腸壁通透性的增加有一定預(yù)防和治療作用。

急性胰腺炎; 瘦素; 一氧化氮合酶; 腸壁通透性; 大黃素

急性胰腺炎（acute pancreatitis, AP）是一種發(fā)生在正常胰腺組織的炎癥性疾病, 80%的患者為良性進(jìn)程, 死亡率為1%; 20%的患者可能發(fā)展為更嚴(yán)重的器官功能不全, 即重癥急性胰腺炎, 發(fā)病率和死亡率明顯增加。在胰腺炎患者中, 內(nèi)毒素血癥, 腹部感染和敗血癥是其主要的并發(fā)癥, 這些感染很可能來源于胃腸道細(xì)菌移位, 特別是胰腺炎患者多表現(xiàn)為腸黏膜屏障障礙更證明了這一點(diǎn)。因此, 在重癥急性胰腺炎期間維護(hù)腸黏膜屏障對(duì)于延遲疾病的發(fā)展, 減少死亡率有重要意義[1]。

腸道是產(chǎn)生炎性介質(zhì)的一個(gè)重要源泉, 腸道所產(chǎn)生的炎癥因子和其他介質(zhì)如內(nèi)毒素能激活胰腺內(nèi)誘生型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）合成, 導(dǎo)致細(xì)胞間介質(zhì)的一氧化氮（nitric oxide, NO）過量表達(dá)。經(jīng)此途徑的NO過量表達(dá)是急性胰腺炎血流動(dòng)力學(xué)紊亂的一個(gè)重要因素[2]。瘦素是脂肪細(xì)胞分泌的一種激素, 參與能量代謝調(diào)節(jié), 研究表明急性胰腺炎時(shí)瘦素可以通過調(diào)節(jié)iNOS而改變NO的含量[3]。近年來, 大黃素用于AP治療的研究取得了很大的進(jìn)展, 已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明, 在急性胰腺炎時(shí)應(yīng)用大黃素可以提高血中瘦素的水平[4]。本研究旨在通過建立大鼠AP模型, 觀察大黃素干預(yù)對(duì)AP大鼠血漿內(nèi)淀粉酶、血清瘦素、胰腺組織中iNOS活性和NO表達(dá)及腸黏膜通透性的影響, 探討大黃素對(duì)AP時(shí)腸黏膜屏障保護(hù)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組與處理

SD 雌性大鼠60只, 體質(zhì)量200～250 g。由河北醫(yī)科大學(xué)生理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為AP組、假手術(shù)組和大黃素組, 每組20只。所有大鼠常規(guī)室溫鼠料喂養(yǎng), 術(shù)前12 h禁食, 自由飲水, 1%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉（30 mg/kg）。無菌條件下, 取上腹部正中切口入腹腔, 提起胃、十二指腸, 顯露胰腺, 確認(rèn)膽胰管, 無創(chuàng)血管夾鉗夾膽胰管的上下兩端, 采用加工的1ml注射器針頭距肝門0.3cm潛行穿刺膽胰管, 插入膽胰管0.3 cm, 指壓穿刺點(diǎn), 查無漏膽后, AP和大黃素組以0.2 ml/min速度推注5%?；悄懰徕c（Sigma公司）溶液, 劑量為1.5 ml/kg;注畢壓迫穿刺孔5 min后去無創(chuàng)血管夾, 見胰腺明顯水腫后, 逐層關(guān)腹腔并計(jì)時(shí); 假手術(shù)組按照胰腺炎造模方法, 胰膽管內(nèi)注射生理鹽水。大黃素組于關(guān)腹前腹腔注射5 g/L大黃素溶液（淮安久泰生化公司）, 給藥體積5 ml/kg; AP組和假手術(shù)組注入等量生理鹽水。

1.2 標(biāo)本采集方法

術(shù)后大鼠分籠飼養(yǎng), 自由飲水。術(shù)后23 h, 三組大鼠按上述方法麻醉后行頸動(dòng)脈插管, 由此管緩慢推注1 ml125I-清蛋白后動(dòng)脈夾夾閉頸動(dòng)脈近端; 1 h后去除動(dòng)脈夾取血標(biāo)本, 加少許肝素混勻, 2500 r/min離心15 min, 取血漿-20℃保存待測(cè)定。24 h時(shí)放血處死動(dòng)物后立即剖腹結(jié)扎10 cm末端回腸; 收集并稱取腸內(nèi)容物, 取胰腺及回腸組織作標(biāo)本。其中胰腺組織分成兩部分: 一部分10%福爾馬林固定, 用于胰腺組織形態(tài)觀察; 另一部分制成勻漿,-20 ℃保存, 用于測(cè)定胰腺組織NO含量和iNOS活性。

1.3 觀察項(xiàng)目及檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 血清淀粉酶（amylase, AMY）檢測(cè) 取保存待測(cè)樣本, 用全自動(dòng)生化分析儀（Cobasmira公司, 瑞士）測(cè)定。

1.3.2 胰腺組織iNOS活性測(cè)定 采用Sigma公司iNOS檢測(cè)試劑盒, 利用同位素標(biāo)記法測(cè)定iNOS活性。iNOS活性以單位時(shí)間內(nèi)每mg蛋白生成L-胍氨酸的pmol數(shù)即mol/（mg·min）表示。

1.3.3 胰腺組織中NO含量測(cè)定 采用南京建成生物工程研究所提供的NO檢測(cè)試劑盒, NO硝酸還原酶法測(cè)定。

1.3.4 血清瘦素測(cè)定 按照瘦素放射免疫分析測(cè)試盒（北方生物技術(shù)研究所, 北京）說明書操作。

1.3.5125I-清蛋白測(cè)定 術(shù)后23 h, 如前所述麻醉動(dòng)物后行頸動(dòng)脈插管, 緩慢推注19.5×105cpm/ml125I-清蛋白（福瑞生物工程公司, 北京）1 ml, 1 h后剖腹, 結(jié)扎10 cm末端回腸, 收集并稱取腸內(nèi)容物, 同時(shí)采血0.5 ml。二者均用Gambyt-CRγ-計(jì)數(shù)器（德普公司, 美國(guó)）測(cè)定放射性。用累積指數(shù)表示腸黏膜通透性[5]。累積指數(shù)= 腸內(nèi)容物放射性（cpm/g）×100/血液放射性（cpm/ml）。

1.3.6 病理學(xué)檢查 取相同部位胰腺及回腸組織, 10%福爾馬林固定, 石蠟包埋切片后HE染色, 光學(xué)顯微鏡下觀察。胰腺病理評(píng)分參考Schmidt評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[6]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 組間比較采用方差分析。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物一般情況

AP組動(dòng)物可觀察到精神萎糜、卷曲、活動(dòng)少、進(jìn)食飲水差, 有嘔吐等現(xiàn)象。假手術(shù)組動(dòng)物活動(dòng)反應(yīng)敏捷, 進(jìn)食飲水良好。大黃素組一般情況較假手術(shù)組差, 但較AP組好。

2.2 血清AMY和瘦素水平的變化

AP組和大黃素組的AMY顯著高于假手術(shù)組（＜0.05）, 大黃素組AMY明顯低于AP組（＜0.05）; AP組和大黃素組瘦素水平明顯高于假手術(shù)組（＜0.05）, 大黃素組血清瘦素水平明顯高于AP組（＜0.05; 表1）。

表1 3組動(dòng)物血清AMY、瘦素、胰腺iNOS和NO濃度的變化

注: AMY: 淀粉酶; iNOS: 誘生型一氧化氮合酶。與假手術(shù)組比較,*＜0.05; 與AP組比較,#＜0.05

2.3 胰腺iNOS活性與NO含量的變化

AP組胰腺組織中iNOS活性和NO水平顯著高于假手術(shù)組（＜0.05）; 與AP組比較, 大黃素組胰腺組織中NO含量和iNOS活性明顯下降（＜0.05;表1）。

2.4 125I-清蛋白累積指數(shù)的變化

AP組和大黃素組的125I-清蛋白累積指數(shù)明顯高于假手術(shù)組（＜0.05）; 大黃素組125I-清蛋白累積指數(shù)顯著低于AP組（＜0.05; 表2）。

2.5 胰腺及回腸組織病理變化

假手術(shù)組胰腺和回腸結(jié)構(gòu)未見異常。AP組胃腸積液積氣明顯, 腹水為血性, 腹腔內(nèi)廣泛皂化斑; 胰腺間質(zhì)有不同程度水腫、充血, 小葉間隙、腺泡間隙及細(xì)胞間隙增寬, 出現(xiàn)不同程度的出血、壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn); 腸黏膜上皮細(xì)胞可見變性、壞死, 絨毛排列紊亂及脫落, 毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血。大黃素組病理改變較假手術(shù)組重, 但較AP組輕, 胰腺僅有點(diǎn)狀壞死, 回腸黏膜絨毛基本完整無水腫（圖1, 2）。AP組的病理評(píng)分分值明顯高于大黃素和假手術(shù)組（＜0.05）; 而大黃素組分值顯著低于AP組（＜0.05; 表2）。

圖1 胰腺組織病理改變

Figure 1 Pathological changes of pancreatic tissue (HE staining ×200)

A: 假手術(shù)組; B: AP組; C: 大黃素組

圖2 回腸組織病理改變

Figure 2 Pathological changes of ileal tissue (HE staining ×200)

A: 假手術(shù)組; B: AP組; C: 大黃素組

表2 3組動(dòng)物125I-清蛋白累積指數(shù)和胰腺組織病理評(píng)分

注: 與假手術(shù)組比較,*＜0.05; 與AP組比較,P＜0.05

3 討 論

AP時(shí)由于腸黏膜屏障功能受損, 細(xì)菌移位造成胰周感染, 從而繼發(fā)全身感染, 導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征及多器官功能衰竭[6], 是導(dǎo)致急性胰腺炎患者死亡的主要原因。

NOS可分為兩種形式: 結(jié)構(gòu)型NOS（constitutive nitric oxide synthase, cNOS）和iNOS, cNOS存在于腦和內(nèi)皮細(xì)胞, 在正常情況下即可被激活產(chǎn)生NO, 所產(chǎn)生的NO主要作用于位于血管平滑肌中的鳥苷酸循環(huán)中的鳥苷酸環(huán)化酶, 使cGMP水平增高, 導(dǎo)致血管擴(kuò)張。iNOS存在于巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、激活的中性粒細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞中, 為病理性酶。在正常條件下, 細(xì)胞內(nèi)iNOS表達(dá)甚少, 但在某些特殊情況, 如在脂多糖和細(xì)胞因子的作用下, iNOS表達(dá)增高, 且可維持一段時(shí)間, 其催化產(chǎn)生的過量NO, 可能產(chǎn)生組織細(xì)胞毒[7]。

AP時(shí)腸壁通透性增高的原因, 一方面是由于胰腺病理損害引起有效循環(huán)血量不足, 腸道處于缺血、缺氧狀態(tài), 激活腸道局部釋放大量血小板、腫瘤壞死因子α等, 導(dǎo)致腸黏膜屏障功能的損傷; 另一方面, AP時(shí)胰腺組織內(nèi)iNOS過度表達(dá), 導(dǎo)致血中NO明顯升高, 現(xiàn)已有研究表明NO水平與AP時(shí)腸道損傷有密切的關(guān)系[8,9]。

瘦素是由肥胖基因編碼的蛋白質(zhì), 由脂肪細(xì)胞和各種其他細(xì)胞分泌。有研究表明, 急性胰腺炎時(shí), 血清瘦素的表達(dá)增加, 其通過以下途徑發(fā)揮AP時(shí)對(duì)胰腺的保護(hù)作用:（1）提高胰腺組織的血流量[10]; （2）促進(jìn)胰腺細(xì)胞生成, 抑制促炎性因子白介素1β的釋放[9];（3）提高cNOS, 降低iNOS活性[11,12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 大黃素組血清瘦素水平較AP組明顯增高, 提示大黃素在AP時(shí)對(duì)胰腺的保護(hù)作用可能與升高血清瘦素水平有關(guān)。

大黃在臨床上用于治療AP已寫入急性重癥胰腺炎治療指南, 本研究表明給予AP大鼠大黃素干預(yù), 可抑制胰腺的炎癥反應(yīng), 降低腸壁的通透性, 對(duì)胰腺具有較好的保護(hù)作用, 其作用機(jī)制可能與升高了血清中的瘦素水平有關(guān)。

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（編輯: 任開環(huán)）

Relationship of pancreatic inducible nitric oxide synthase expression and serum leptin with intestinal permeability and effect of emodin on it in rats with acute pancreatitis

WU Hui*, XIE Hongmei, LIU Jiangkui, LUO Jun, HUANG Zejun, LI Jiangning

(Department of Gastroenterology, Huabei Petroleum General Hospital, Renqiu 062552, China)

To investigate the effects of emodin on inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression of pancreatic tissue, serum leptin and intestinal permeability in rats with acute pancreatitis(AP) and the relative mechanism.Sixty adult SD rats were randomly divided into three groups: sham operation group, AP group, and emodin treatment group, with 20 in each group. The expressions of iNOS and NO in pancreatic tissue were measured. Blood amylase(AMY) and serum content of leptin were detected. Intestinal permeability was measured by albumin clearance(AC) of125I-labeled rat serum albumin. The histopathologic changes of pancreas and ileum were observed.The blood AMY, plasma content of leptin, cumulative125I-labeled serum albumin index and the levels of iNOS and NO in pancreatic tissue were significantly higher in AP group and emodin treatment group than in sham operation group(＜0.05). Compared with AP group, in emodin treatment group, the levels of iNOS and NO in pancreatic tissue, the blood AMY and cumulative125I-labeled serum albumin index were significantly decreased(＜0.05); the serum content of leptin was increased; the pathological changes of pancreas and ileum were significantly alleviated(＜0.05).The increase of intestinal permeability in rats with AP may be induced by overexpression of NOaction of iNOS. Emodin is effective in the increase of the serum leptin and the decrease of iNOS. Emodin has certain preventive and therapeutic effects on bowel wall permeability decrease in AP rats.

acute panereatitis; leptin; nitric oxide synthase; intestinal permeability; emodin

R576

A

10.3724/SP.J.1264.2012.00033

2011-04-01;

2011-06-13

吳 暉, Tel: 0317-2728354, E-mail: wuuhui@126.com