常金芳，郁建鋒，冀宏

（常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟 215500）

白靈菇rDNA-ITS序列多態(tài)性分析

常金芳，郁建鋒，冀宏

（常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟 215500）

為了研究10個(gè)不同來(lái)源的白靈菇品種親緣關(guān)系，采用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列分析技術(shù)，系統(tǒng)分析了不同地區(qū)白靈菇ITS的多態(tài)性.用ClustalX、MEGA4等軟件分析結(jié)果顯示，10個(gè)不同來(lái)源的白靈菇具有很近的親緣關(guān)系，其中有9個(gè)品種的同源性高達(dá)98.5%，其可能來(lái)自同一品系，而另一個(gè)品種與其他9個(gè)差異較大，此可能來(lái)自其他品系或是一株突變品種.

白靈菇；rDNA-ITS序列；親緣關(guān)系

白靈菇屬于真菌門、擔(dān)子菌綱、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬，為掌狀白阿魏菇，卯曉嵐[1]將其命名為Pleurotus nebrodensis（Lnzengae）Quel.野生白靈菇在中國(guó)僅分布于新疆地區(qū)，其形狀似靈芝，菇體為純白色，肉質(zhì)細(xì)膩，味道鮮美，朵型適中，口感特佳，是一種名貴食（藥）用真菌[2].研究發(fā)現(xiàn)，白靈菇具有防治老年人心血管疾病、防癌抗癌等藥用功效[3].白靈菇含有多種營(yíng)養(yǎng)成分，能調(diào)節(jié)機(jī)體生理平衡、增強(qiáng)人體免疫功能[4-5]，享有“西天白靈芝”、“天山神菇”之美譽(yù)，深受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的青睞，有廣闊的開(kāi)發(fā)前景.

Internal transcribed spacer（ITS）序列進(jìn)化速率較快且片段長(zhǎng)度適中（高等真菌一般小于1000 bp），加上協(xié)同進(jìn)化，使得其在基因組中不同重復(fù)單元間十分一致，成為高等真菌屬內(nèi)種間及種群系統(tǒng)學(xué)研究的基因標(biāo)記[6].ITS1和ITS2是中度保守區(qū)域，其保守性基本上表現(xiàn)為種內(nèi)相對(duì)一致，種間差異較為明顯.這種特點(diǎn)使ITS適合于真菌物種的分子鑒定及屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析[7-9].目前已被廣泛應(yīng)用于真菌屬內(nèi)不同種間或近似屬間的系統(tǒng)發(fā)育研究中[10].

目前，白靈菇迅速走俏市場(chǎng)，其栽培規(guī)模也日益擴(kuò)大，但由于命名的隨意性，生產(chǎn)中同種異名和同名異種現(xiàn)象嚴(yán)重，導(dǎo)致白靈菇栽培菌株混亂，影響了產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展.通過(guò)對(duì)10種不同生產(chǎn)區(qū)域來(lái)源的白靈菇ITS序列進(jìn)行分析，探討其種內(nèi)和種間的遺傳變異，為白靈菇種質(zhì)鑒定及培育和優(yōu)產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，提供基礎(chǔ)保障.

1 材料與方法

1.1 菌種

分別從國(guó)內(nèi)不同區(qū)域的市場(chǎng)菌種銷售機(jī)構(gòu)購(gòu)買了北京吉蕈天山1號(hào)、河北武安天山2號(hào)、北京吉蕈農(nóng)大白靈菇2號(hào)、江都天達(dá)白靈菇2號(hào)、福建龍海白靈菇、河南鄭州白靈菇3、高郵白靈菇1號(hào)、北京吉蕈高溫白靈菇、北京吉蕈京白靈菇、高郵白靈菇2號(hào)等10個(gè)不同命名的白靈菇菌種.

1.2 方法

1.2.1 白靈菇菌絲體培養(yǎng)

將10個(gè)不同命名的白靈菇菌種在PDA固體培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)7 d后，接種約0.1 cm3大小的菌種塊于100 m L的PDA液體培養(yǎng)基，25℃靜置2 d后，180 r/m in繼續(xù)振蕩培養(yǎng)7 d[11].收集菌絲體，并保存于-70℃冰箱.

1.2.2 CTAB法提取基因組DNA

參照Guo[12]等和Saghai[13]等的方法，將上述操作收集到的菌絲體（濕重約0.6 g）置于陶瓷研缽中，加入適量的液氮進(jìn)行研磨，將研磨得到的粉末轉(zhuǎn)移到1.5 m L EP管中，加入700μL裂解緩沖液（0.1 mol/L Tris-Hcl，pH 8.0；0.02 mol/L EDTA，pH 8.0；1.4 mol/L NaCl；2%CTAB），置于65℃水浴消化3～4 h.然后以酚、氯仿抽提法獲得白靈菇的基因組DNA，于-70℃保存.

1.2.3 PCR擴(kuò)增ITS片段

ITS引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[10-11].PCR擴(kuò)增100μL體系：70μL ddH2O，10μL 10×PCR buffer，8μL dNTP（2.5 mmol/L each），ITS1/ITS4（10 pmol/L）各2μL；5 ng DNA模板；1μL Taq酶（5 U/μL）.PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min.

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并克隆入pMD 18-T Vector，送至上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序.

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Clustal X軟件和MEGA4.1軟件對(duì)所獲得的10個(gè)白靈菇ITS序列進(jìn)行分析[14,16-17].采用最大簡(jiǎn)約法，構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)，自展次數(shù)為1000次.

2 結(jié)果

2.1 ITS目的片段的擴(kuò)增

以引物ITS1和ITS4擴(kuò)增了10個(gè)白靈菇品種的ITS片段，從圖1可以看出供試菌株擴(kuò)增出來(lái)的ITS片段約在680 bp左右，而北京吉蕈農(nóng)大白靈2號(hào)的PCR條帶明顯短于其余9個(gè)品種，基本與預(yù)期設(shè)計(jì)的片段大小相一致.

2.2 ITS序列分析

對(duì)10個(gè)白靈菇菌種的ITS序列對(duì)比分析（見(jiàn)圖2），結(jié)果顯示，北京吉蕈天山1號(hào)、河北武安天山2號(hào)、江都天達(dá)白靈菇2號(hào)、河南鄭州白靈菇3、北京吉蕈京白靈菇和高郵白靈菇1號(hào)的ITS序列是相同的；福建龍海白靈菇與北京吉蕈高溫白靈菇菌株的ITS序列是相同的.高郵白靈菇2號(hào)的ITS序列在第428個(gè)堿基處較其他白靈菇的多插入了1個(gè)堿基；北京吉蕈農(nóng)大白靈菇2號(hào)的ITS序列與其余9個(gè)菌種的差異性較大，存在較多的序列缺失[15].

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

2.3.1 10個(gè)白靈菇品種的遺傳距離

利用MEGA4.1軟件對(duì)10個(gè)白靈菇的ITS序列進(jìn)行遺傳關(guān)系分析，結(jié)果顯示（見(jiàn)表1），北京吉蕈天山1號(hào)、河北武安天山2號(hào)、北京吉蕈京白靈菇、高郵白靈菇1號(hào)、高郵白靈菇2號(hào)、河南鄭州白靈菇3和江都天達(dá)白靈菇2號(hào)兩兩之間的遺傳距離都為0.000，福建龍海白靈菇和北京吉蕈高溫白靈菇與以上7個(gè)品種之間的遺傳距離也只有0.007，說(shuō)明這9個(gè)品種的白靈菇在ITS區(qū)的變異積累并不明顯.北京吉蕈農(nóng)大白靈菇2號(hào)與其余9個(gè)品種的遺傳距離較大，為4.337，推斷其與其他白靈菇的來(lái)源可能有所不同.

圖1 白靈菇ITS PCR產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖2 10個(gè)白靈菇品種的ITS區(qū)域序列對(duì)比結(jié)果

表1 以ITS序列獲得的10個(gè)白靈菇遺傳距離結(jié)果

2.3.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

利用CLUSTALX1.83、MEG4軟件，以供試白靈菇菌株的ITS序列構(gòu)建其分子進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)一步分析10個(gè)白靈菇之間的親緣關(guān)系.結(jié)果分析（圖3）顯示，10個(gè)白靈菇品種分為3大分支，北京吉蕈天山1號(hào)、河北武安天山2號(hào)、北京吉蕈京白靈菇、高郵白靈菇1號(hào)、高郵白靈菇2號(hào)、河南鄭州白靈菇3和江都天達(dá)白靈菇2號(hào)聚類于同一個(gè)分支，它們之間的自展支持率為91%，大于70%.而福建龍海白靈菇和北京吉蕈高溫白靈菇在同一個(gè)分支上，它們之間的自展支持率為88%，也大于70%，而后這2個(gè)分支聚類形成一個(gè)大的分支.北京吉蕈農(nóng)大白靈菇2號(hào)單獨(dú)形成一分支，也說(shuō)明其與其他9個(gè)品種白靈菇的ITS發(fā)生了變異積累.

3 討論

圖3 基于ITS序列分析構(gòu)建的最簡(jiǎn)約系統(tǒng)樹(shù)

本文對(duì)所克隆的10個(gè)來(lái)自不同地區(qū)的白靈菇的ITS序列進(jìn)行了遺傳分析，并構(gòu)建了其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù).以北京吉蕈天山1號(hào)、河北武安天山2號(hào)之間的遺傳距離為0.000，在聚類分析中其也在同一分支上，福建龍海白靈菇、北京吉蕈高溫白靈菇之間的遺傳距離為0.000，且自展支持率為88%，與以上7個(gè)白靈菇品種的遺傳距離也只有0.007，推測(cè)這9個(gè)品種可能來(lái)自于同一品系，也有可能這9個(gè)品種的白靈菇ITS序列并沒(méi)有達(dá)到亞種的遺傳變異積累.而北京吉蕈農(nóng)大白靈菇2號(hào)與其余9個(gè)品種的遺傳距離為4.337左右，在聚類分析中單獨(dú)形成一分支，推斷其可能來(lái)源于其他品系或是產(chǎn)生的新突變株.

ITS區(qū)域的基因序列進(jìn)化速率較快，且在基因組中不同重復(fù)單元之間基本一致，現(xiàn)為高等真菌屬種內(nèi)及種群系統(tǒng)學(xué)研究的基因標(biāo)記之一[18-19].對(duì)10個(gè)來(lái)自不同地區(qū)的白靈菇ITS序列分析結(jié)果表明，只有北京吉蕈農(nóng)大白靈菇2號(hào)與其他的差異較大，而其余的差異不明顯.這說(shuō)明此9個(gè)白靈菇品種可能來(lái)自同一品系的栽培種，也可能是ITS序列分析還不能十分精確地反映出這9個(gè)白靈菇之間的差異.因?yàn)镮TS序列作為分子標(biāo)記應(yīng)用技術(shù)的最大限制是有的真菌由于進(jìn)化順序、變異、甚至分析方法等原因，在間隔區(qū)上表現(xiàn)的差異性較小，作為屬內(nèi)種及種群的標(biāo)記存在著一定的不足[10，20].此研究結(jié)果雖然為白靈菇的種內(nèi)關(guān)系的研究提供了重要參考數(shù)據(jù)，但還需結(jié)合其他方法如SRAP標(biāo)記的全基因分析、白靈菇的形態(tài)包括營(yíng)養(yǎng)體和子實(shí)體的鑒定才能更為科學(xué)地鑒定不同來(lái)源、不同品系的白靈菇之間的親緣關(guān)系.

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An analysis of rDNA-ITS Sequence Polym orphism in Pleurotus nebrodensis

CHANG Jin-fang,YU Jian-feng,JIHong
(School of Biology and Food Engineering,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500,China)

In order to study the phylogenetic relationship of 10 Pleurotus nebrodensis strains collected from differ?ent regions,ITS sequence analysis was used.ITS sequences were amplified using primer ITS1(5′-TCCGTAGGT?GAACCTGCGG-3′)and ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′),and analyzed using ClustalX and MEGA4 software.The results showed that the ten P.nebrodensis had a very close relationship.The similarity of 9 strains was 98.5%and they might come from the same strain.The other one was a little different from them.It might come from the other strains or be amutant variety.

Pleurotus nebrodensis;rDNA-ITS sequence;phylogenetic relationship

Q933

A

1008-2794（2012）08-0061-05

2012-06-16

常熟市農(nóng)業(yè)科技項(xiàng)目“‘村企掛鉤’食用菌設(shè)施農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化高效栽培技術(shù)集成與示范”（CN201001）；蘇州市應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目“白靈菇種質(zhì)資源評(píng)價(jià)及其工廠化栽培良種選育”（SYN201007）；江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目“食用菌低碳高效生產(chǎn)技術(shù)體系建設(shè)與示范”（BE2011456）

常金芳（1990—），女，江蘇鹽城人，生物工程專業(yè)2008級(jí)本科生.

冀宏（1969—），男，河北保定人，教授，博士，研究方向：食、藥用真菌工程技術(shù)，E-mail：jihong@cslg.edu.cn.