陳盛強(qiáng)羅學(xué)港楊泉曹開誼孫衛(wèi)文陳希張維雯黃越玲劉國彬沈巖松戴麗軍易詠紅

·論 著·

GSK3抑制劑氯化鋰對脆性X綜合征模型小鼠避暗行為的干預(yù)作用☆

陳盛強(qiáng)*△羅學(xué)港*楊泉*△曹開誼△孫衛(wèi)文△陳?！鲝埦S雯※黃越玲△劉國彬△沈巖松△戴麗軍△易詠紅△

【摘要】目的 探討糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase3，GSK3）抑制劑氯化鋰對脆性X綜合癥小鼠模型的避暗行為的干預(yù)作用及機(jī)制。方法 通過對30日齡脆性X綜合癥小鼠連續(xù)腹腔注射不同劑量氯化鋰5 d，用藥第4天和第5天進(jìn)行避暗實(shí)驗(yàn)；同時用免疫印跡技術(shù)檢測Fmr1 knockout（KO）及 wild type（WT）小鼠的海馬和皮層總GSK 3β和磷酸化GSK 3β（P-GSK3β）的變化。結(jié)果 在避暗實(shí)驗(yàn)中，KO鼠與 WT鼠，兩者潛伏期及錯誤次數(shù)分別為（56±32）s，（83±24）s；（7±3）次，（3±2）次；免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果：KO鼠皮層及海馬 P-GSK3β表達(dá)平均灰度值分別為 69，63；WT鼠皮層和海馬均為 100。注射氯化鋰后，KO鼠和 WT鼠總GSK3β無明顯改變，而KO鼠60 mg／kg，120 mg／kg，200 mg／kg組皮層P-GSK3β表達(dá)平均灰度值分別為：147，151，234；海馬P-GSK3β分別為108，111，146，較空白組增多；P＜0.05。WT鼠用氯化鋰后，潛伏期和錯誤次數(shù)以及P-GSK3β表達(dá)變化無統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論 氯化鋰能改善KO鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，可能與氯化鋰導(dǎo)致的P-GSK3β的表達(dá)增加有關(guān)，對脆性X綜合征基因敲除小鼠有治療作用。

【關(guān)鍵詞】脆性X綜合癥 FMR1基因敲除 避暗實(shí)驗(yàn)GSK3β 磷酸化GSK3β 氯化鋰

脆性X綜合癥（fragile X syndrome，F(xiàn)XS）是最常見的遺傳性智力低下疾病之一，它是由X連鎖的FMR1基因5′端（CGG）n三核苷酸重復(fù)序列異常擴(kuò)增及其相鄰部位的CpG島異常甲基化，使其編碼產(chǎn)物FMRP（fragile X mental retardation protein）不能正常表達(dá)所致［1］，研究還發(fā)現(xiàn)Fmr1基因敲除小鼠腦GSK3的活性異常，鋰是GSK3的抑制劑，是否能改善KO小鼠的異常表型。本實(shí)驗(yàn)通過避暗實(shí)驗(yàn)，觀察Fmr1基因敲除小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力變化，同時觀察使用氯化鋰后小鼠學(xué)習(xí)記憶的改善情況，并采用免疫印跡技術(shù)檢測鼠腦GSK3β和P-GSK3β表達(dá)變化，探討GSK3抑制劑氯化鋰是否能改善KO小鼠的學(xué)習(xí)能力及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與用藥處理 Fmr1基因敲除型（KO）純合子（－／－）及其野生型（WT）純合子（＋／＋）FVB近交系小鼠由荷蘭伊拉斯塔斯大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)及遺傳學(xué)研究中心Oostra BA教授惠贈，廣州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)及繁殖。所有實(shí)驗(yàn)動物的操作及飼養(yǎng)均符合廣東省及廣州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物管理飼養(yǎng)條例，遵循人道原則。實(shí)驗(yàn)動物選用30日齡組，不分雌雄，分為KO和WT兩大組。KO及WT每組又分為6小組：空白對照組（0組）：腹腔注射生理鹽水（NS）；以及5個用藥組：分別腹腔注射30 mg／kg、60 mg／kg、90 mg／kg、120 mg／kg、200 mg／kg氯化鋰。每組15只，共180只小鼠。6個實(shí)驗(yàn)小組分別對應(yīng)的血鋰濃度分別是：對照組：0 mmol／L、實(shí)驗(yàn)組：0.71 mmol／L、1.42 mmol／L、2.13 mmol／L、2.84 mmol／L［2］、4.73 mmol／L。血鋰濃度中2.84 mmol／L對應(yīng)120 mg／kg氯化鋰是從參考文獻(xiàn)［3］中獲得，其余均為對應(yīng)按比例稀釋得出。所有小鼠使用前做基因鑒定，確保小鼠的品種為KO鼠或WT鼠；每一窩KO或WT小鼠，每次均采用隨機(jī)分組的方法，分成6個實(shí)驗(yàn)組；所有的小鼠連續(xù)5 d腹腔注射氯化鋰（Sigma），第4天、第5天打藥30 min后做避暗試驗(yàn)；第6天打藥30 min后取腦組織，海馬及皮層做蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)，所有的小鼠均在上午9：00至12：00試驗(yàn)。

1.2 基因型鑒定 實(shí)驗(yàn)動物的基因型鑒定參照文獻(xiàn)［4］。

1.3 避暗實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)［4］。

1.4 組織制備與蛋白免疫印跡分析 小鼠第6天打藥30 min后，脫臼斷頭取腦，冰上分離取大腦皮層和海馬，按照100 mg組織加入1000 μL全細(xì)胞裂解液，10 μL的PMSF（苯甲基磺酰氟（Phenylmehanesulfonyl fluoride，PMSF））、10 μL的磷酸酶抑制劑（三種試劑均購于廣州美津生物公司），用手持式勻漿器勻漿，低溫離心機(jī)4℃，14 000 g離心5 min，取上清液。GSK3β和P-GSK3β（cell signaling technology），蛋白免疫印跡檢測：檢測GSK3β取15 μg全細(xì)胞蛋白，檢測P-GSK3β時取45 μg全細(xì)胞蛋白，蛋白提取液與Sample buffer（10%SDS）混合，沸水煮5 min，兩種抗體均用10%的SDS-PAGE進(jìn)行電泳分析，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行免疫印跡雜交反應(yīng)。步驟如下：5%的脫脂奶粉封閉1 h；分別與GSK3β（1∶6000稀釋）和P-GSK3β（1∶2000稀釋）一抗雜交反應(yīng)4℃過夜；加二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H＋L）（碧云天）室溫雜交反應(yīng) 1 h；加入ECL反應(yīng)4 min后，暗室X膠片曝光，顯影和定影。免疫印跡用光密度法（quantity One）定量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析所有結(jié)果均用（±s）表示；避暗實(shí)驗(yàn)中的同一組實(shí)驗(yàn)前后兩天的比較采用配對t檢驗(yàn)；避暗實(shí)驗(yàn)中KO與WT鼠同一天實(shí)驗(yàn)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；避暗實(shí)驗(yàn)中KO或WT鼠同一天實(shí)驗(yàn)6種用藥劑量間比較采用單因素方差分析；蛋白印跡實(shí)驗(yàn)中KO與WT鼠的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，同一種鼠用藥劑量間的比較用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 小鼠DNA鑒定結(jié)果 KO和WT小鼠基因PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。經(jīng)PCR在KO小鼠擴(kuò)增出約為800 bp的DNA片斷；在WT小鼠擴(kuò)增出約為468 bp的DNA片斷。

2.2 避暗實(shí)驗(yàn) 第1天是學(xué)習(xí)階段，錯誤次數(shù)比WT鼠多（P＜0.05），而避暗潛伏期沒有差異（P＞0.05）；第2天是檢測小鼠記憶能力，KO鼠避暗潛伏期明顯比WT鼠減小，錯誤次數(shù)比WT鼠多（P＜0.05），提示與WT鼠比較，KO鼠的學(xué)習(xí)記憶有缺陷的。

圖2～3為KO鼠和WT鼠分別用藥氯化鋰腹腔注射5 d后，不同劑量間對小鼠學(xué)習(xí)記憶行為的改善作用。KO鼠用藥氯化鋰的5個不同劑量后，與對照組生理鹽水比較，KO鼠用藥120 mg／kg和200 mg／kg組避暗潛伏期有明顯升高 （P＜0.05），避暗錯誤次數(shù)有明顯下降（P＜0.05）。用5種氯化鋰的劑量給WT鼠用藥，發(fā)現(xiàn)90 mg／kg、120 mg／kg和200 mg／kg組使WT鼠的避暗潛伏期有所升高，但沒有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），避暗錯誤次數(shù)也沒有明顯的改變 （P＞0.05），提示氯化鋰對WT鼠沒有改善作用。

2.3 免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見圖4（A～F）。圖A顯示，在小鼠的皮層和海馬，KO鼠的蛋白P-GSK3β表達(dá)量比WT鼠少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；圖B顯示，KO鼠皮層和海馬的GSK3β表達(dá)量與WT鼠比較，沒有顯著差異（P＞0.05）。圖C，D為KO鼠使用4種不同劑量的氯化鋰 （0 mg／kg、60 mg／kg、120 mg／kg、200 mg／kg）用藥后，皮層和海馬蛋白 PGSK3β、GSK3β表達(dá)的改變，由圖可見，用藥后，與對照組0 mg／kg（即生理鹽水組）比較，P-GSK3β在皮層和海馬的表達(dá)，有統(tǒng)計學(xué)意義的升高 （P＜0.05）；GSK3β的改變不明顯，沒有明顯統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）。圖E，圖F分別是給氯化鋰0 mg／kg組和120 mg／kg組，用藥后兩種蛋白（P-GSK3β與GSK3β）在WT鼠腦組織（皮層與海馬）的表達(dá)。由圖可見，給氯化鋰120 mg／kg組與對照組0 mg／kg（生理鹽水）組比較，P-GSK3β的表達(dá)上升，有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）；GSK3β表達(dá)沒有明顯改變，（P＞0.05）。

3 討論

到目前為止脆性X綜合癥還沒有找到有效的治療藥物。近些年的研究提出鋰可能對FXS有治療作用［5］。這就給我們很好的啟示，因?yàn)殇囎鳛榍榫w穩(wěn)定劑已經(jīng)在人類使用了多年，其作用機(jī)理可能對GSK3的抑制［6］，人們對它的藥物代謝動力學(xué)，安全性和耐受性都很了解［7］。因此，進(jìn)一步的研究主要是應(yīng)用鋰劑后GSK3的變化和KO鼠特有性狀表型的變化的關(guān)系。Min WW等［3］報告，在Fmr1基因敲除小鼠，P-GSK3表達(dá)是減少的，GSK3的活性是增高的。Yuskaitis等［8］報告用GSK-3抑制劑氯化鋰能改善Fmr1 KO小鼠的特有表型，使KO鼠曠場試驗(yàn)的活動性降低。

我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，KO鼠避暗潛伏期比WT鼠小，錯誤次數(shù)比WT鼠多（P＜0.05），提示KO鼠的學(xué)習(xí)記憶有缺陷的。使用連續(xù)5 d的氯化鋰治療后，KO鼠的避暗潛伏期增加，錯誤次數(shù)減少，其中120 mg／kg和200 mg／kg劑量組有明顯統(tǒng)計學(xué)意義，提示120 mg／kg和200 mg／kg的氯化鋰對KO鼠的學(xué)習(xí)記憶有改善作用。而對于WT鼠，避暗潛伏期和避暗錯誤次數(shù)用藥后沒有明顯改變。這些結(jié)果表明氯化鋰用藥后對KO鼠的學(xué)習(xí)記憶改善明顯，對WT鼠沒有明顯改善，而且在氯化鋰的治療窗內(nèi)，藥物作用與用藥濃度的增加是成正相關(guān)的。

圖1 KO和WT小鼠FMR1基因片斷PCR擴(kuò)增結(jié)果

表1 KO和WT小鼠避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝15）

表1 KO和WT小鼠避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝15）

1）與WT鼠比較，P＜0.05

潛伏期（s） 錯誤次數(shù)（次／5 min）鼠種WT KO第1天29±16 26±12第2天83±24 56±321）第1天8±2 12±31）第2天3±2 7±31）

圖2 避暗實(shí)驗(yàn)中KO及WT小鼠各氯化鋰用藥組的潛伏期。a：KO鼠對比WT鼠，P＜0.05。

圖3 避暗實(shí)驗(yàn)中KO及WT小鼠各氯化鋰用藥組的錯誤次數(shù)。a：KO鼠對比WT鼠，P＜0.05

圖4 免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果。A：WT與KO鼠蛋白P-GSK3β比較；B：WT與KO鼠蛋白GSK3β比較； 圖C：給氯化鋰4種不同劑量后P-GSK3β在KO鼠皮層的表達(dá)； D：給氯化鋰4種不同劑量后GSK3β在KO鼠海馬的表達(dá)；E：氯化鋰0 mg／kg組和120 mg／kg組用藥后P-GSK3β在WT鼠皮層的表達(dá)；F：氯化鋰0 mg／kg組和120 mg／kg組用藥后GSK3β在WT鼠海馬的表達(dá)。

我們檢測了溶媒對照組的KO和WT鼠的PGSK3β和GSK3β的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在小鼠的皮層和海馬，KO鼠的蛋白P-GSK3β表達(dá)量比WT鼠少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而總GSK3β表達(dá)量與WT鼠相比無顯著差異（P＞0.05），從而證實(shí)KO鼠GSK3的抑制受損。與Yuskaitis等［8］的研究結(jié)果相一致 。推測在FVB Fmr1 KO鼠的腦區(qū)，皮質(zhì)和海馬，由于GSK3β絲氨酸磷酸化減少，而導(dǎo)致GSK3β的抑制性調(diào)節(jié)異常。KO和WT鼠腹腔注射氯化鋰6 d后，分別取皮層和海馬觀察用藥后P-GSK3β表達(dá)量變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種不同劑量的氯化鋰均能增加KO鼠皮層和海馬的P-GSK3β的表達(dá)量，具有劑量依賴效應(yīng)，而對總的GSK3β表達(dá)量改變不明顯，提示小鼠的學(xué)習(xí)記憶改善可能與P-GSK3β表達(dá)升高有關(guān)，KO鼠的GSK3絲氨酸磷酸化缺陷可以通過鋰增加GSK3磷酸化水平來調(diào)節(jié)，與Min WW等2009年的研究結(jié)果一致。

我們的實(shí)驗(yàn)是對前人在果蠅［9］和C57BL／6J× FVB／NJ Fmr1 KO鼠［3］實(shí)驗(yàn)的一個補(bǔ)充和延伸；已經(jīng)有文獻(xiàn)證實(shí)GSK3與FXS的mGluR學(xué)說有關(guān)［10］，因?yàn)閙GluR拮抗劑MPEP能增加KO鼠的GSK3磷酸化［8］，而在WT鼠沒有，這提示升高的mGluR信號對GSK3的活性是起作用的。我們應(yīng)用氯化鋰處理KO鼠得出的結(jié)果正好與前人用MPEP處理的結(jié)果相符，這說明氯化鋰也可能是通過mGluR途徑來起作用，但具體的機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。鋰能夠恢復(fù)KO鼠的異常行為補(bǔ)充了鋰可能對FXS病人提供治療益處的學(xué)說。因此，鋰可能對FXS病人的治療起作用。

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（責(zé)任編輯：李立）

☆ 廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號：815101700100005），廣東省科技計劃項(xiàng)目（編號：2008B030301371，2009B030801368）

* 中南大湘雅醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)系 （長沙 410013）

△ 廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院

※ 廣州醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院

【中圖分類號】R742

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

收稿日期：（2011－05－31）

doi：10.3969／j.issn.1002－0152.2012.08.009

通訊作者（E-mail：chenshengq66＠gmail.com）

Theraputic effects of lithium chloride on passive avoidance behavior in a mouse model of Fragile X Syndrome.

CHEN Shengqiang，LUO Xuegang，YANG Quan，CAO Kaiyi，SUN Weiwen，CHEN Xi，ZHANG Weiwen，HUANG Yueling，LIU Guobin，SHEN Yansong，DAI Lijun，YI Yonghong.Department of Human Anatomy and Neurobiology College of Basic Medicine Central South University，Changsha 410013，China.Tel：020－34152641.

【Abstract】Objective To study the theraputic effects of lithium chloride on step-through behaviors and the activity of Glycogen Synthase Kinase 3β（GSK3β）in Fragile X Syndrome in mice.Methods Thirty-day-old wildtype（WT）or Fmr1 KO littermates received either normal saline or different doses of lithium chloride（30 mg／kg，60 mg／kg，90 mg／kg，120 mg／kg or 200 mg／kg）for five consecutive days.Step-through testing was used to detect the latency period and error count at 4 and 5 days following lithium treatment.Meanwhile，Western blot was used to examine the expression of GSK3β and Phosphorylated GSK3β（P-GSK3β）in mouse hippocampus and cortex.Results Compared with non-treated WT mice， non-treated KO mice had shorter latency period and more error counts in passive avoidance tests， suggesting that KO mice had learning and memory impairments.The expression level of phosphorylated P-GSK3β） was lower in Fmr1 KO than in WT mice.Lithium treatment could recover the learning and memory impairments and increase the expression level of P-GSK3.Conclusions Lithium ameliorates passive avoidance impairment probably through increasing the expression of P-GSK3βin the Fmr1 knockout mice.

【Key words】Fragile X Syndrome Fmr1 gene knockout mice Step-through test Glycogen synthase kinase3β Phosphorylated GSK3β Lithium Chloride