楊清銳，于成成，楊杏林

(山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院，濟(jì)南 250021)

萊姆病(LD)是一種由伯氏螺旋體(Borrelia burgdorferi)感染引起的全身慢性傳染病。伯氏螺旋體分為10個(gè)基因型，具致病性的3個(gè)基因型分別是伯氏疏螺旋體、伽氏疏螺旋體(Borrelia garinii)及阿氏疏螺旋體(Borrelia afzelii)。北美流行的病原體主要是伯氏疏螺旋體，亞、歐洲則以伽氏疏螺旋體和阿氏疏螺旋體為主。

1 伯氏螺旋體實(shí)驗(yàn)室檢查

伯氏疏螺旋體是單細(xì)胞疏松盤繞的左旋螺旋體，由表層、外膜、鞭毛和原生質(zhì)柱四部分構(gòu)成。其基因組由一個(gè)線狀910 kb染色體和20多個(gè)5～56 kb的線狀、環(huán)狀質(zhì)粒組成。鞭毛蛋白基因位于線狀染色體，編碼具有高度保守性的336個(gè)氨基酸序列，相對(duì)分子質(zhì)量為41 ku，其肽鏈中央?yún)^(qū)域氨基酸組成為種特異性抗原表達(dá)位點(diǎn)，也是LD血清學(xué)診斷的抗原標(biāo)志。OspA和OspB基因位于線狀質(zhì)粒，OspC基因位于環(huán)狀質(zhì)粒，亦是LD的主要抗原性外膜蛋白。伯氏螺旋體實(shí)驗(yàn)室檢查主要分為病原體檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)。

1.1 病原學(xué)檢測(cè) ①病原體直接鏡檢:LD患者血液、腦脊液、關(guān)節(jié)液、尿液等體液涂片可直接置于顯微鏡暗視野下鏡檢。游走性紅斑、關(guān)節(jié)滑膜或淋巴結(jié)等組織活檢切片則需經(jīng)品紅法等染色處理后鏡檢。此種常規(guī)的直接鏡檢法較為可靠，但受樣本低含菌量限制易漏診、病原體檢出率極低，如能加做直接熒光抗體染色檢查或可提高檢出率。②病原體分離培養(yǎng):采集LD患者血液、腦脊液、關(guān)節(jié)液等體液或組織標(biāo)本加入MPK培養(yǎng)基培養(yǎng)，分離病原體并置于顯微鏡暗視野下鏡檢是診斷LD的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但受伯氏疏螺旋體菌量少、培養(yǎng)周期長、實(shí)驗(yàn)操作條件要求嚴(yán)格、部分患者已進(jìn)行抗生素治療等因素影響，本法難以在臨床常規(guī)開展。

1.2 血清學(xué)檢測(cè) LD血清學(xué)檢測(cè)常用方法包括間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和免疫蛋白印跡試驗(yàn)(Western bloting)等。目前國際上通用兩步法診斷 LD，第一步采用IFA法或ELISA檢測(cè)抗體，第二步采用Western bloting對(duì)陽性標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證。①IFA試驗(yàn):IFA法是最早應(yīng)用于LD檢測(cè)的血清學(xué)方法。靶抗原采用伯氏疏螺旋體的顆粒性抗原。我國和歐洲多采用的陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)如下:IFA檢測(cè)單份血清如lgM抗體滴度≥1∶64、lgG抗體滴度≥1∶128，或檢測(cè)雙份血清抗體滴度大于4倍。本法操作簡便易行，結(jié)果較為可靠。②ELISA:ELISA法試劑靶抗原包括B31菌株全菌超聲波勻漿抗原、重組外膜蛋白抗原100 ku、41 ku及OspA、OspC等。其中，全菌抗原試劑因成分特異性不高，與梅毒螺旋體、鉤端螺旋體等其他種屬螺旋體存在交叉反應(yīng)而逐漸被臨床淘汰。純化后的重組外膜蛋白抗原可一定程度上提高實(shí)驗(yàn)敏感性和特異性，優(yōu)于IFA試驗(yàn)。ELISA法可檢測(cè)出大多數(shù)LD急性期病例。另外，有研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)LD患者腦脊液中抗LD抗體陽性檢出率和滴度均高于血清，且腦脊液中的高滴度抗體提示神經(jīng)鞘內(nèi)存在著活躍的感染。③免疫蛋白印跡試驗(yàn):此法因可分離不同的蛋白質(zhì)并鑒定其相對(duì)分子質(zhì)量大小而多被用于檢測(cè)伯氏疏螺旋體特異性蛋白抗體，主要用于確認(rèn)試驗(yàn)。2004年中國疾病預(yù)防控制中心(CDC)傳染病預(yù)防控制所針對(duì)基因型伽氏疏螺旋體制定的標(biāo)準(zhǔn)如下:OspA、OspC、17 kD、30 kD、39 kD、58 kD、66 kD、83/100 kD中至少有一條蛋白帶顯色即可診斷IgG 陽性。OspA、OspC、17 kD、30 kD、14 kD、58 kD、83/100 kD中至少有一條蛋白帶顯色可診斷IgM陽性，41 kD顯色者則須進(jìn)一步作梅毒螺旋體和鉤端螺旋體的鑒別診斷。

一般來說，分析上述血清學(xué)檢查結(jié)果需注意以下幾點(diǎn):①LD感染早期或伴有免疫抑制患者可呈抗體檢測(cè)陰性。②臨床抗生素濫用致抗體檢測(cè)陽性率降低。③可能和梅毒、鉤端螺旋體、回歸熱等感染患者出現(xiàn)交叉反應(yīng)而呈假陽性。④部分LD現(xiàn)癥者及既往感染者難以區(qū)分。因此，臨床應(yīng)對(duì)LD患者血清進(jìn)行雙份(甚至動(dòng)態(tài))抗體滴度檢測(cè)。

1.3 分子生物學(xué)檢測(cè) ①聚合酶鏈反應(yīng)(PCR):本法多取用LD患者體液及皮膚、關(guān)節(jié)滑膜等受累臟器進(jìn)行伯氏疏螺旋體特異性核酸片段檢測(cè)。主要檢測(cè)靶基因包括鞭毛蛋白p66編碼基因、OspA編碼基因、OspB編碼基因、16S rRNA基因和5S/23S rRNA間隔基因區(qū)等。PCR法具有快速方便、靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。但本法有兩點(diǎn)值得注意:一是PCR法的高敏感性對(duì)存在微量交叉污染的標(biāo)本容易出現(xiàn)假陽性;二是PCR可從死菌中擴(kuò)增DNA，其陽性結(jié)果并不一定提示有活菌感染。②反向線點(diǎn)雜交技術(shù)(Reverse line blot，RLB):本法主要檢測(cè)靶基因是伯氏疏螺旋體5S-23S rRNA基因間隔區(qū)序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，其中一對(duì)引物的一條鏈用生物素標(biāo)記，PCR擴(kuò)增后再與設(shè)計(jì)的單鏈種特異性寡核苷酸探針進(jìn)行雜交反應(yīng)。此法具有高特異性和高敏感性。

2 LD診斷

LD的診斷需要根據(jù)流行病學(xué)資料、接觸史、臨床癥狀及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果綜合分析判斷。目前臨床多采用美國疾病控制中心提出的LD診斷標(biāo)準(zhǔn)，即符合下列任何1條者均可診斷為LD:①在流行區(qū)，有慢性游走性紅斑(單個(gè)紅斑的直徑必須至少為5 cm，并應(yīng)由醫(yī)生檢查確定)或抗伯氏疏螺旋體抗體滴度≥1∶256，及1個(gè)或1個(gè)以上器官系統(tǒng)受累。②在非流行區(qū)，有慢性游走性紅斑及抗伯氏疏螺旋體抗體滴度≥1∶256，或有慢性游走性紅斑及1個(gè)或1個(gè)以上器官系統(tǒng)受累，或抗體滴度≥1∶256及1個(gè)或1個(gè)以上器官系統(tǒng)受累。