張安紅，羅曉麗，肖娟麗，王志安，吳家和

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，山西運(yùn)城044000；2.中國科學(xué)院微生物研究所，北京100101）

Btcry基因是從蘇云金芽孢桿菌中分離的編碼殺蟲晶體蛋白ICPs的基因，是目前研究最為深入、應(yīng)用范圍最廣的一類殺蟲基因。這種殺蟲蛋白對(duì)鱗翅目昆蟲有毒殺活性。近20 a來，編碼這種殺蟲晶體蛋白的基因已經(jīng)成功應(yīng)用于植物基因工程，培育出多種轉(zhuǎn)基因抗蟲植物。其中，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花和抗蟲玉米在生產(chǎn)上得到大規(guī)模的商業(yè)應(yīng)用，取得了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。雖然轉(zhuǎn)基因作物的種植與應(yīng)用有效地控制了害蟲為害，但是，隨著種植面積的不斷擴(kuò)大，尤其在沒有采取庇護(hù)所等防范措施下，害蟲對(duì)其產(chǎn)生抗性的幾率也越來越大。目前，有很多報(bào)道指出，害蟲對(duì)轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)生了不同程度的抗性[1-2]。當(dāng)前在中國，大面積種植轉(zhuǎn)cry1A基因棉花，很好地控制了棉鈴蟲的危害，減少了農(nóng)藥的使用。正因?yàn)槿绱耍斐闪艘郧安皇敲藁ㄖ饕οx的大發(fā)生，如盲椿象、小菜蛾和粉紋夜蛾等。經(jīng)過多年的種植，轉(zhuǎn)Btcry1A基因棉花對(duì)棉鈴蟲的抗性有所下降[3-4]。因此，開發(fā)和利用其他類型的殺蟲基因是當(dāng)前十分迫切的要求。與ICPs相比，Vip是Bt營養(yǎng)期生長階段分泌的蛋白，它不形成晶體，在氨基酸序列上與ICPs沒有同源性，對(duì)鱗翅目、鞘翅目和同翅目等多種農(nóng)林害蟲有殺蟲活性，是一類新型的殺蟲蛋白。Vips主要分為Vip1，Vip2和Vip3，在Vip3中已發(fā)現(xiàn)多個(gè)類型，其中，Vip3A蛋白是一種廣譜殺蟲蛋白，其對(duì)草地貪夜蛾（Spodoptra frugiperda）、甜菜夜蛾（Spoaoptera exigua）、煙蚜夜蛾（Heliothis virescens）等害蟲有較高的毒殺作用[5]。因此，Vip3蛋白作為新的殺蟲資源在研究和應(yīng)用方面具有巨大的潛力。

1 Vip3的特性及其殺蟲活性

Vip3和Cry毒素在Bt中產(chǎn)生的時(shí)間不一樣，Vip3在Bt對(duì)數(shù)生長中期開始分泌，以可溶性蛋白形式分泌在培養(yǎng)基中，在Bt生長穩(wěn)定前期到達(dá)高峰，而且在產(chǎn)孢期和產(chǎn)孢后期均保持高分泌量；而Cry在Bt生長穩(wěn)定期開始分泌，在胞內(nèi)形成晶體蛋白。Vip3和Cry毒素的物理特性也不一樣，Vip3具有熱不穩(wěn)定性，在90℃處理20 min時(shí)失活；而Cry毒素具有較好的熱穩(wěn)定性[5]。

Vip3的殺蟲譜和殺蟲活性與ICPs不同。Vip3A對(duì)鱗翅目害蟲具有廣譜的殺蟲活性，如對(duì)棉鈴蟲和甜菜夜蛾高毒，對(duì)秋黏蟲的毒性比Cry1Ab和Cry1Fa高，對(duì)煙蚜夜蛾、小菜蛾也具有高殺蟲活性[6-8]，殺蟲活性均達(dá)納克級(jí)水平。小地老虎對(duì)ICPs具有很強(qiáng)的抗性，但對(duì)Vip3A非常敏感；與Cry1A相比，Vip3A對(duì)小地老虎的毒性高出260多倍[5]，對(duì)粉紋夜蛾和煙蚜夜蛾也具有良好的殺蟲活性[9-10]。

2 Vip3的作用機(jī)理

Vip3殺蟲機(jī)理主要體現(xiàn)在毒素對(duì)昆蟲中腸細(xì)胞的破壞。組織病理學(xué)表明，小地老虎飼喂含Vip3A飼料24 h后，昆蟲的中腸上皮柱狀細(xì)胞末端膨大成球狀，杯狀細(xì)胞在形態(tài)上有所改變，但沒有受到明顯的損傷；48 h后，上皮柱狀細(xì)胞破裂，內(nèi)腔充滿降解的細(xì)胞碎片，杯狀細(xì)胞受到明顯的損傷，但這2種細(xì)胞仍然與基膜相連接；72 h后，中腸上皮層完全脫落，小地老虎死亡。

Vip3與已知的ICPs沒有序列同源性和結(jié)構(gòu)相似性。ICPs對(duì)昆蟲的毒殺作用主要是在昆蟲中腸的高pH條件下溶解殺蟲的晶體毒素，經(jīng)過一系列蛋白酶作用，C-端部分氨基酸首先被切除，N-端28個(gè)氨基酸隨后也被切除，最終活性片段在cadherin類蛋白作用下形成聚合體，與中腸刷狀緣膜囊上的特異性受體相結(jié)合，在細(xì)胞膜上產(chǎn)生離子通道，引起細(xì)胞膜穿孔，細(xì)胞破裂，造成昆蟲生化代謝及生理功能失調(diào)，停止進(jìn)食，最后死亡[11]。Vip3為可溶性蛋白，不需通過昆蟲中腸的消化即可直接起作用，Vip3以可溶形式進(jìn)入昆蟲消化系統(tǒng)，到達(dá)中腸后經(jīng)過一系列的蛋白酶作用，形成核心蛋白與中腸細(xì)胞結(jié)合，引起細(xì)胞膜穿孔，細(xì)胞破裂，造成昆蟲生化代謝及生理功能失調(diào)，停止進(jìn)食，最后死亡[12]。

3 轉(zhuǎn)Vip3基因作物研究與應(yīng)用

種植轉(zhuǎn)基因抗蟲作物是治理害蟲的一個(gè)有效途徑。目前，世界各地已有多個(gè)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了含有不同Vip3基因的轉(zhuǎn)基因植物載體，并將其導(dǎo)入玉米、棉花和水稻等作物中[13]。Vip3新菌株、新殺蟲特性、新殺蟲蛋白及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)，為培育抗蟲轉(zhuǎn)基因植物提供了新的基因資源。

Estruch將培育出的轉(zhuǎn)Vip3Aa基因抗蟲玉米申請(qǐng)專利。他構(gòu)建的T-DNA載體使用不同的啟動(dòng)子（全株表達(dá)的泛素啟動(dòng)子，在葉綠體中表達(dá)的PEPC啟動(dòng)子，在根際表達(dá)的MTL啟動(dòng)子）控制改造過的Vip3Aa基因（提高GC含量，使用玉米偏好密碼子）在玉米中進(jìn)行表達(dá)。結(jié)果表明，這些啟動(dòng)子控制下的轉(zhuǎn)Vip3Aa基因玉米對(duì)于多種玉米害蟲（如小地老虎、甜菜夜蛾、秋黏蟲和粉紋夜蛾）均有殺蟲活性[14]。先正達(dá)公司已成功地將Vip3A導(dǎo)入不同作物，得到高效抗蟲多價(jià)轉(zhuǎn)基因玉米、棉花，增加了轉(zhuǎn)基因作物的抗蟲譜，同時(shí)延緩了害蟲的抗性發(fā)展。Syngenta公司將Vip3a20基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入棉花中獲得的轉(zhuǎn)基因棉花COT102進(jìn)行注冊(cè)，該轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)鱗翅目害蟲如棉鈴蟲、煙蚜夜蛾、粉紋夜蛾、秋黏蟲、甜菜夜蛾等均具有較高抗性[15]。而將Vip3a20轉(zhuǎn)入玉米中獲得的轉(zhuǎn)基因玉米MIR162已進(jìn)行了全面的評(píng)估，發(fā)現(xiàn)其對(duì)環(huán)境和人類健康均無影響[15]。同時(shí)，該公司還注冊(cè)1種含有Vip3Aa和Cry1Ab基因的轉(zhuǎn)基因棉花VipCot。這種棉花通過轉(zhuǎn)Vip3A和Cry1Ab基因的棉花雜交獲得。該棉花表達(dá)高劑量的殺蟲毒素（轉(zhuǎn)基因棉花表達(dá)的毒素至少是此毒素殺死敏感昆蟲的25倍），對(duì)美洲棉鈴蟲和煙蚜夜蛾飼喂該棉花幼嫩葉片的試驗(yàn)顯示，對(duì)2種害蟲的殺蟲率達(dá)到100%。人工接蟲試驗(yàn)顯示，超過20 000頭的美洲棉鈴蟲或者煙蚜夜蛾被分別接種到轉(zhuǎn)基因植株上，經(jīng)過7 d，植株上的害蟲只有幾十頭，經(jīng)過14 d，害蟲全部被殺死。試驗(yàn)結(jié)果表明，這種轉(zhuǎn)基因抗蟲棉對(duì)鱗翅目害蟲的防治效果良好[15]。另外，印度國際基因工程和生物技術(shù)中心利用合成的Vips基因構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因煙草和棉花也已在田間試驗(yàn)[16]。

浙江大學(xué)沈志成實(shí)驗(yàn)室（2006，中國專利，CN1818067A）構(gòu)建了一個(gè)轉(zhuǎn)基因植物T-DNA載體，載體組件為全株表達(dá)的泛素啟動(dòng)子和具有植物密碼偏好的Vip3基因。此載體用基因槍或者農(nóng)桿菌的方法轉(zhuǎn)入植物愈傷組織中，使用愈傷組織進(jìn)行生物測定。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因愈傷組織對(duì)稻縱卷葉螟、二化螟、玉米螟和秋黏蟲有100%的殺蟲活性。沈志成實(shí)驗(yàn)室還將Cry-Vip融合基因構(gòu)建成轉(zhuǎn)基因植物T-DNA載體轉(zhuǎn)入水稻中，成功獲得對(duì)二化螟和稻縱卷葉螟有抗性的轉(zhuǎn)基因水稻[17-18]。從2005年開始，中國科學(xué)院微生物研究所與山西省農(nóng)科院棉花研究所等單位合作，開始進(jìn)行Vip3A的棉花轉(zhuǎn)化與培育，現(xiàn)已通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得120個(gè)轉(zhuǎn)化后代，通過3 a的選育獲得了Vip3A蛋白表達(dá)量高的純合系，可望實(shí)現(xiàn)對(duì)棉花鱗翅目害蟲廣譜高抗的育種目標(biāo)[19]。

4 展望

營養(yǎng)期殺蟲蛋白Vip極大地豐富了Bt的殺蟲毒素種類；由于營養(yǎng)期殺蟲蛋白與晶體毒素蛋白的殺蟲機(jī)理不同，而且營養(yǎng)期殺蟲蛋白Vip與Cry殺蟲晶體蛋白具有協(xié)同增效作用，所以，二者共同使用，不但能提高殺蟲毒力，更重要的是能夠有效地克服和延緩昆蟲對(duì)Bt毒素抗藥性的產(chǎn)生；這些特性將為人工構(gòu)建特異高毒力工程菌和轉(zhuǎn)基因抗蟲植物提供新的思路和基因資源。隨著新的cry基因不斷涌現(xiàn)，必將為重要農(nóng)業(yè)害蟲的防治提供更多的選擇，為Bt毒素殺蟲機(jī)理和抗性機(jī)制的基礎(chǔ)研究創(chuàng)造有利條件。

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