李平 綜述 汪茂榮 審校

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染呈世界流行，每年約有100萬人死于HBV相關的肝衰竭、肝硬化和肝細胞癌，已成為一個嚴重的公共衛(wèi)生問題[1，2]。核苷（酸）類藥物（Nucleos/tide analogues）是目前治療慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的重要藥物，具有抑制病毒迅速、作用效果明顯、使用方便和不良反應少等特點，但是大多接受核苷（酸）類藥物治療的患者難以在短期內(nèi)達到持久應答，而且隨著治療時間的延長，HBV易產(chǎn)生變異耐藥，造成抗病毒治療的失敗。隨著核苷（酸）類藥物種類的增加，可通過聯(lián)合或替代的方法挽救變異耐藥，但是位于逆轉錄酶（reverse transcriptase，RT）區(qū)B亞區(qū)第181位氨基酸的變異給抗病毒治療提出了一個新的“挑戰(zhàn)”，因為其變異后不僅僅對阿德福韋產(chǎn)生耐藥，而且對拉米夫定、恩替卡韋、替比夫定、替諾福韋的藥物敏感性均呈現(xiàn)下降，是一個交叉核苷和核苷酸兩類藥物的耐藥位點[3]。

一、rt181變異的概念

野生型HBV rt181位氨基酸是丙氨酸（Ala，A），編碼的堿基為GCT。rt181變異主要有兩種模式：當編碼密碼子第一位堿基的G突變?yōu)锳后，氨基酸變異為蘇氨酸（Thr，T），可寫作rtA181T；而當編碼第二位堿基的C突變?yōu)門后，丙氨酸則變異為纈氨酸（Val，V），可寫作rtA181V。由于HBV聚合酶基因和表面抗原基因存在部分重疊區(qū)域，RT區(qū)的變異也引起S區(qū)的改變，rtA181T變異可導致S蛋白第172位色氨酸（Trp，W）變異為終止密碼子，寫作sW172*；或者置換變異為亮氨酸（Leu，L），寫作sW172L。而rtA181V變異則導致S蛋白第173位氨基酸由亮氨酸（Leu，L）變異為苯丙氨酸（Phe，F(xiàn)），寫作 sL173F。

二、rt181變異的產(chǎn)生

臺灣學者Yeh等[4]最早報道了rt181變異，其對23例拉米夫定治療耐藥的患者進行分析，其中有3位患者體內(nèi)HBV沒有出現(xiàn)常見的YMDD（M552I/V）變異，而是出現(xiàn)了A529T（rtA181T）變異，他們進一步用定點突變的方法在體外證明了rtA181T變異株對拉米夫定耐藥。2004年Chien[5]等也報道在接受拉米夫治療的CHB患者中，有1例患者出現(xiàn)了A529T（rtA181T）變異，并且在停藥1年后還能檢測到該變異的存在。2006年，法國學者Gerolami等[6]報道在2例接受拉米夫定治療的患者中，出現(xiàn)rt181的另一種變異模式，即rtA181V變異。

一項關于阿德福韋的多中心隨機雙盲對照研究發(fā)現(xiàn)[7]，185例患者經(jīng)過144周的治療后，除了3例出現(xiàn)rtN236T變異外，另有3例患者出現(xiàn)rtA181V耐藥變異。Yeon等[8]給67例拉米夫定耐藥的患者換用阿德福韋治療，治療7周后，有2例患者在出現(xiàn)rtA181T變異；治療12周后，有5例患者出現(xiàn)rtA181V變異。在替比夫定治療的患者中，也同樣發(fā)現(xiàn)rt181位點的變異的存在。替比夫定Ⅲ期全球注冊的臨床研究結果提示[9]，在治療52周HBV DNA陽性的115名患者中，有16人出現(xiàn)rt181位點的變異。而在恩替卡韋初始治療的患者中，國內(nèi)302醫(yī)院趙攀等[10]對5例HBV rtA181T/V變異患者的臨床資料進行回顧性調(diào)查和隨訪后認為：rtA181T/V變異的產(chǎn)生與恩替卡韋治療無關，其變異為自然產(chǎn)生。Warner等[11]對SeqHepB數(shù)據(jù)庫中患者資料進行分析后發(fā)現(xiàn)，在未接受任何抗病毒治療的患者中可檢測到rtA181T變異的存在。

三、變異的臨床特點

（一）變異發(fā)生率 rt181變異的發(fā)生率在不同研究中的比例略有區(qū)別。澳大利亞的SeqHepB數(shù)據(jù)庫中統(tǒng)計資料顯示[11]：在拉米夫定治療變異的患者中，rtA181T比例為2%；在阿德福韋治療變異的患者中，rtA181T比例為18%，rtA181V的比例達到50%。而在未接受抗病毒治療的患者中，rtA181T出現(xiàn)的概率為0.2%。國內(nèi)徐東平等[12]對340例CHB患者體內(nèi)HBV進行耐藥分析，其中rtA181T變異檢出率3.2%，rtA181V檢出率0.3%，rtA181T/V/I檢出率0.6%。國內(nèi)另一篇文獻[13]對85例CHB患者的HBV測序后發(fā)現(xiàn)，有2例患者發(fā)生rtA181T變異，2例rtA181V變異，1例rtA181S變異。

（二）變異的組合 和rt204變異一樣，rt181變異既可單獨存在，又可與其他變異同時存在，不同變異可存在于同一株病毒株上，也可分別存在于不同的病毒株。對rt181變異患者的HBV的RT區(qū)序列進行克隆分析，發(fā)現(xiàn)rtA181T/V變異可單獨存在，也可與 N236T、M204V/I、N236+N238T、L80V、L80V+M204I等變異同時存在[14，15]。

四、變異的生物學特點

（一）復制特性 HBV DNA變異后對于病毒復制能力的影響是多種多樣的，可降低其復制能力，可提高其復制能力，或沒有影響。在rt181變異的研究中，大部分學者認為rtA181T變異后，HBV復制能力下降。Yeh等[4]最早發(fā)現(xiàn)rtA181T變異的同時，在體外構建突變株，轉染細胞后檢測復制產(chǎn)物，實驗發(fā)現(xiàn)，rtA181T變異病毒的復制活性比野生型下降了約88%。Warner等[11]構建rtA181T突變質粒轉染到Huh 7細胞后，他們發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)的復制中間體明顯減少，而在細胞培養(yǎng)上清中檢測不到HBV DNA。Yatsuji等[16]通過構建1.4拷貝的HBV rtA181T突變株轉染HepG2細胞后，他們發(fā)現(xiàn)HBV DNA水平下降了約20%。關于rtA181V變異對復制的影響，只有李新艷等[17]學者將臨床分離的rtA181V變異株轉染細胞后，發(fā)現(xiàn)HBV DNA水平與野生型相比并未見明顯差異。而韓國學者[18]將rtA181T/V變異患者的臨床數(shù)據(jù)進行比較，他們將13例rtA181T/V變異患者與9例rt181未變異者配對后認為，兩組患者在HBV DNA水平并沒有表現(xiàn)出差異。國內(nèi)有學者將rtM204位點單獨突變與rtM204+rtA181T突變患者兩者進行比較，發(fā)現(xiàn)引起他們變異所用的核苷酸藥物不同，但兩者病毒學水平無明顯差異[19]，而對rtN236T變異患者與rtA181T變異患者進行比較后，發(fā)現(xiàn)兩組患者的HBV DNA水平也沒有顯著差異[20]。

（二）表面抗原（HBsAg）表達 rtA181T/sW172*變異后，會導致HbsAg合成出現(xiàn)缺陷且引起分泌障礙。Warner等[11]研究發(fā)現(xiàn)，由于該變異提前出現(xiàn)終止密碼子，可使HBsAg截短約55個氨基酸，隨后他們利用Western證實了HBV變異株的表面蛋白減小了6kD；而Western檢測同時發(fā)現(xiàn)轉染變異病毒的Huh7細胞內(nèi)HBsAg含量明顯下降，細胞外HBsAg檢測不到。他們進一步通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，rtA181T/sW172*變異后的HBsAg在細胞漿內(nèi)大量聚集，不能正常分泌到細胞外。盡管在體外研究中證實HBsAg分泌缺陷，但在臨床上，發(fā)生rtAl81T變異患者的血清HBsAg滴度與未變異者并無明顯差異[18]。其可能的原因是：患者體內(nèi)的病毒群是混合的，即同時存在非變異毒株，這些毒株所產(chǎn)生的非變異型HBsAg可以裝配變異的HBV，并糾正分泌缺陷。Warner等[11]按不同比例轉染變異株和未變異株質粒，隨著未變異株質粒所占比例的增加，HBV分泌缺陷能夠被逐漸挽救。國內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)，當rtAl81非變異株占10%時，即可在細胞培養(yǎng)上清液中檢測到HBsAg表達，且隨著非變異株所占比例增加，HBsAg表達也逐步增加，表明rtAl81T/sWl72＊變異株導致的HBsAg分泌缺陷已被rtl81非變異株糾正[17]。

（三）藥物敏感性 藥物敏感性通常用半數(shù)有效濃度（EC50）或半數(shù)抑制濃度（IC50）來評價，其原理是定點突變或從體內(nèi)分離出變異的病毒株，轉染細胞后，再加入不同濃度的核苷（酸）類似物，培養(yǎng)一段時間后檢測HBV復制情況，并與野生株病毒的EC50/IC50比較，判斷耐藥性。目前體外實驗結果提示，rtA181T/V變異病毒對大部分核苷（酸）類藥物均呈現(xiàn)一定程度的耐藥性。Villet等[14]實驗結果提示，rtA181T變異病毒對拉米夫定、阿德福韋、替諾福韋的藥物敏感性分別下降了5.7～10.8倍，2.1～4.5倍，2～2.9倍；rtA181V變異病毒則分別下降了 1.5～7.7倍，2.4～7.8倍，1.2～3.2倍；而 rtA181T或 rtA181V變異病毒對恩替卡韋的敏感性改變尚不明顯。他們研究還發(fā)現(xiàn)，當出現(xiàn)rtA181T/V聯(lián)合rtN236T變異后，耐藥性較rtA181T/V單點變異明顯上升。而有學者等[21]研究發(fā)現(xiàn)，rtA181V變異病毒株對阿德福韋、替諾福韋的敏感性分別降低了4.2倍和3倍；但對拉米夫定、恩替卡韋和恩曲他濱的敏感性降低12～15倍，對其他核苷類似物，包括克來夫定、替比夫定、L-dC、L-dA則呈現(xiàn)完全交叉耐藥（敏感性下降＞80倍）。

（四）與腫瘤關系 臺灣學者Lai等[22]對一位39歲的血清HBeAg陽性，而HBsAg陰性的肝癌患者進行研究，發(fā)現(xiàn)其HBsAg陰轉是由于體內(nèi)HBV出現(xiàn)了rtA181T/sW172*變異。他們進行體外研究發(fā)現(xiàn)rtA181T/sW172*變異能夠轉錄激活猿猴空泡病毒40（SV 40）和癌基因c-Myc，從而促使腫瘤的發(fā)生。而他們利用裸鼠進行的動物實驗結果提示，rtA181T/sW172*變異的細胞可在裸鼠體內(nèi)促使腫瘤的形成。國內(nèi)[23]也報道：rtA181T/sW172*變異后，HBsAg的分泌缺陷導致蛋白在內(nèi)質網(wǎng)中堆積，可激活內(nèi)質網(wǎng)信號通路grp78基因，從而誘使肝癌的發(fā)生。

五、rt181變異的對策

目前尚無臨床試驗對HBV rt181耐藥患者的治療方法進行評價，僅有一些臨床治療的經(jīng)驗報道。有研究[21]報道，接受阿德福韋治療產(chǎn)生rtAl81V變異的患者，改用或加用拉米夫定能使HBV DNA降低2-3個logl0 copies/ml，但并不能完全抑制HBV復制。他們認為rtAl81V變異病毒對替諾福韋敏感性改變最少。但是Patterson等[24]通過96周的隨訪發(fā)現(xiàn)，TDF治療rtA181T/V變異患者的抑制病毒能力明顯下降，尤其是rtA181V合并rtN236T同時變異時，突變株能使TDF抗病毒活性下降10倍以上。Kurashige等[25]報道1位e抗原陽性，HBV DNA大于7.6 log10copies/ml的患者，在接受拉米夫定治療后，出現(xiàn)rtA181T變異，當換用恩替卡韋后，病毒量起初略有下降，隨后即出現(xiàn)反彈，而此時耐藥轉為rtM204V+L180M+S202G變異，當聯(lián)用拉米夫定和阿德福韋后，rtA181T變異再次成為主要變異；最后聯(lián)用恩替卡韋和阿德福韋后，病毒降到了3.7 log10 copies/ml。他們認為恩替卡韋和阿德福韋聯(lián)用，能最大程度控制rtA181T和rtM204V的相關耐藥。而一些個案報道[26]認為，rtA181T/V變異的患者，換用恩替卡韋治療后，能夠有效抑制病毒復制。目前EASL建議[27]這些發(fā)生rtA181T/V變異的患者，給予其加用恩替卡韋，或者使用替諾福韋聯(lián)合恩曲他濱，但是在臨床上能否有效抑制反彈的變異病毒，目前還有待進一步的觀察和隨訪。

六、結語

核苷（酸）類藥物通過與HBV DNA聚合酶的自然底物dNTP競爭，而抑制HBV復制。在藥物或免疫的長期壓力下，在HBV復制過程中（尤其在逆轉錄過程中），由于聚合酶缺乏嚴格校正機制，HBV聚合酶區(qū)會出現(xiàn)較高頻率的變異，相應氨基酸序列改變后影響到空間結構，導致核苷（酸）類藥物與聚合酶結合能力明顯降低，便發(fā)生了耐藥現(xiàn)象。當前除恩替卡韋以外的核苷（酸）藥物幾乎均可導致rt181變異的產(chǎn)生。雖然其變異后病毒缺陷，病毒量不會大幅度的反彈，HBsAg、ALT的水平也沒有明顯改變[28]。但由于其交叉核苷和核苷酸耐藥，對即將在國內(nèi)上市的替諾福韋亦不敏感，因此給臨床長遠的治療用藥帶來困難。

在臨床工作中，我們在努力尋找耐藥變異對策的同時，更應做好耐藥的預防工作。對于需要長期抗病毒治療的患者來說，可選用抑制HBV能力強、耐藥發(fā)生率低的藥物；或選擇核苷與核苷酸類藥物聯(lián)合用藥，以減少或延緩耐藥性的發(fā)生。

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