黎海莉，潘 瑩，申 薇，杜 鵑，康 林*，崔慧先

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北石家莊 050017）

·論 著·

單純?cè)屑に乜诜茉兴帉?duì)大鼠催乳素水平及垂體催乳素細(xì)胞的影響

黎海莉1，潘 瑩2，申 薇1，杜 鵑2，康 林2*，崔慧先2

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北石家莊 050017）

目的探討單純?cè)屑に乜诜茉兴幾笮?8-甲基炔諾酮（levonorgestrel，LNG）對(duì)大鼠垂體催乳素（prolactin，PRL）細(xì)胞形態(tài)以及血清濃度的影響。方法正常雌性SD大鼠分為長(zhǎng)期給藥組和停藥組，應(yīng)用免疫組織化學(xué)和透射電鏡方法，觀察大鼠垂體PRL細(xì)胞形態(tài)變化并檢測(cè)PRL的血清濃度。結(jié)果長(zhǎng)期給藥組PRL免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目增多（P＜0.01）、面積增大（P＜0.05），血清PRL升高（P＜0.01），電鏡下可見(jiàn)PRL細(xì)胞高爾基復(fù)合體發(fā)達(dá)、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，合成與分泌旺盛。停藥后各項(xiàng)觀察指標(biāo)接近正常。結(jié)論應(yīng)用LNG可引起大鼠垂體PRL細(xì)胞的形態(tài)、PRL的合成與分泌及血清PRL濃度的改變，但這一過(guò)程是可恢復(fù)的。LNG使血清PRL濃度升高，對(duì)排卵有一定抑制作用。

避孕藥，口服，激素；垂體；催乳素；大鼠

單純?cè)屑に乜诜茉兴?，?duì)哺乳期婦女和想使用口服形式避孕的婦女，是一種很好的避孕方法選擇［1］。目前，涉及下丘腦-垂體-卵巢軸反饋調(diào)節(jié)機(jī)制的研究報(bào)道，多集中于生殖藥理學(xué)、生化學(xué)與臨床研究方面，缺乏單純?cè)屑に乇茉兴帉?duì)下丘腦-垂體-卵巢軸反饋調(diào)節(jié)的形態(tài)學(xué)資料。我們實(shí)驗(yàn)組一直致力于這方面的研究，在單純?cè)屑に乇茉兴幾笮?8-甲基炔諾酮（levonorgestrel，LNG）的長(zhǎng)期作用下，可使大鼠下丘腦促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）陽(yáng)性神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生改變，LNG使下丘腦GnRH神經(jīng)元的功能處于非活躍狀態(tài)［2］。下丘腦神經(jīng)肽Y神經(jīng)元、下丘腦弓狀核的雌激素受體參與了LNG長(zhǎng)期作用下GnRH分泌的調(diào)節(jié)［3］，在垂體水平，我們還證實(shí)LNG可逆性的反饋調(diào)節(jié)黃體生成素（luteinizing hormone，LH）細(xì)胞的形態(tài)［4］。由于催乳素（prolactin，PRL）水平的升高能使生殖機(jī)能減退，許多研究者觀察了避孕藥與高催乳素血癥的關(guān)系。但是，迄今為止仍未取得一致的結(jié)果［5-6］。LNG是否通過(guò)影響垂體催乳素細(xì)胞而發(fā)揮其反饋調(diào)節(jié)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本文應(yīng)用免疫組織化學(xué)、透射電鏡等技術(shù)，在垂體水平探討LNG對(duì)PRL細(xì)胞的形態(tài)及血清PRL濃度的影響，以期為臨床避孕藥物的應(yīng)用提供形態(tài)學(xué)資料。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物及分組：選用健康成年雌性SD大鼠23只，體質(zhì)量200～250g（河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），自然光照、室溫（22±3）℃、自由飲食飲水飼養(yǎng)。大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組大鼠分為長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)組7只（喂藥90d）和停藥實(shí)驗(yàn)組7只（停藥后繼續(xù)普通喂養(yǎng)20d）。實(shí)驗(yàn)組大鼠每天上午9時(shí)左右灌胃服用溶于食用麻油的LNG 50mg·kg-1· d-1，對(duì)照組（9只）灌服等量食用麻油。

1.2 取材及切片：依據(jù)陰道涂片結(jié)果，分別將處于動(dòng)情期的實(shí)驗(yàn)組及其相應(yīng)對(duì)照組的大鼠稱質(zhì)量，心臟取血后迅速使用4%多聚甲醛經(jīng)主動(dòng)脈行灌流固定，靜置1h。所取心臟血樣，室溫下低速離心（2 000r/min）20min，-20℃?zhèn)溆么郎y(cè)。取垂體入Bouin液固定12h，常規(guī)脫水透明，石蠟包埋，用組織切片機(jī)從垂體頭側(cè)向尾側(cè)做冠狀連續(xù)切片，片厚4μm，切片裱于涂有多聚賴氨酸的載片上。每例垂體連續(xù)集片于10組載玻片（同一載玻片相鄰2張切片間隔40μm）［4］，入37℃溫箱內(nèi)干燥24h，備用。

1.3 免疫組織化學(xué)法：常規(guī)石蠟切片脫蠟至水、依次進(jìn)入0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.4），3%過(guò)氧化氫（甲醇稀釋）常溫孵育，10%正常山羊血清、豚鼠抗大鼠PRL抗體（由協(xié)和醫(yī)科大學(xué)提供，磷酸鹽緩沖液1∶4 000稀釋），4℃冰箱過(guò)夜。生物素標(biāo)記的1∶100兔抗鼠IgG（由北京中山生物技術(shù)有限公司提供），37℃溫箱、濕盒內(nèi)孵育30min。1∶100辣根過(guò)氧化物酶的鏈霉卵白素（由北京中山生物技術(shù)有限公司提供），37℃溫箱、濕盒內(nèi)孵育30min。用DAB-H2O2顯色3min，自來(lái)水停顯，脫水，透明，中性樹(shù)膠封固。

1.4 電鏡取材及觀察：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物斷頭后，迅速取其垂體，將其切成直徑1mm的細(xì)塊，浸入2.5%戊二醛磷酸緩沖液（pH 7.6）中室溫固定48h，PBS沖洗，再入1%鋨酸后固定1h，PBS沖洗，丙酮逐級(jí)脫水，Epon812包埋，LKB-Ⅴ型超薄切片機(jī)切片，片厚約50nm。切片用枸櫞酸鉛及醋酸雙氧鈾染色，日立H-7500型透射電子顯微鏡觀察。

1.5 計(jì)算機(jī)圖像分析：根據(jù)大鼠垂體冠狀切面上，前葉、中間葉和后葉出現(xiàn)的形態(tài)學(xué)特征，每只大鼠分別在垂體頭端部、中間部和尾端部選擇典型切片［4］。應(yīng)用ZL-2000型計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)在相應(yīng)切片上測(cè)定單位視野內(nèi)（0.01mm2）PRL細(xì)胞的個(gè)數(shù)及其面積，平均灰度和形狀等參數(shù)。

1.6 血清PRL濃度測(cè)定：應(yīng)用美國(guó)德普公司自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（IMMULITE系統(tǒng)）及原裝試劑盒測(cè)定血清PRL濃度［4］。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SAS8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PRL細(xì)胞的免疫組織化學(xué)觀察結(jié)果：大鼠腺垂體PRL免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞的胞質(zhì)呈淺黃色，細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則形，常單個(gè)分布于細(xì)胞索內(nèi)，細(xì)胞多靠近毛細(xì)血管，或有細(xì)長(zhǎng)突起至毛細(xì)血管附近（圖1A）。長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)組單位視野內(nèi)PRL細(xì)胞個(gè)數(shù)為（2.68±0.35）個(gè)，多于長(zhǎng)期對(duì)照組的（1.11±0.14）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖1B，C）。停藥實(shí)驗(yàn)組（1.39±0.19）個(gè)，同停藥對(duì)照組（1.21± 0.13）個(gè)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。停藥實(shí)驗(yàn)組同長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)組相比，細(xì)胞數(shù)目減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖1D）。長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)組PRL細(xì)胞面積為（156.85±22.66）μm2，大于長(zhǎng)期對(duì)照組的（114.91±22.04）μm2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。停藥實(shí)驗(yàn)組（126.16±22.64）μm2，同停藥對(duì)照組（129.55±15.83）μm2相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。停藥實(shí)驗(yàn)組同長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)組相比，面積減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 腺垂體超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果：PRL細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)含有卵圓形或不規(guī)則形顆粒，直徑500～700nm，胞質(zhì)內(nèi)還含有許多平行排列的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、小泡及高爾基復(fù)合體。實(shí)驗(yàn)組大鼠PRL細(xì)胞呈合成與分泌旺盛的表現(xiàn)，細(xì)胞核核膜清晰，常染色質(zhì)豐富；胞漿內(nèi)分泌顆粒較少，顆粒大小不等，高爾基復(fù)合體發(fā)達(dá)，常圍在一起，形成大圈狀；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，常呈同心圓排列（圖2）。

2.3 血清PRL濃度測(cè)定結(jié)果：長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)組（18.62±3.84）mU/L同對(duì)照組（10.89±1.82）mU/L相比，血清濃度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。停藥實(shí)驗(yàn)組（10.11±1.39）mU/L同對(duì)照組（11.74±1.94）mU/L相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而同長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)組相比，血清PRL濃度下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討 論

甾體避孕藥的避孕機(jī)制是多環(huán)節(jié)的，其中抑制排卵是避孕作用的關(guān)鍵所在。正常的排卵依賴于下丘腦-垂體-卵巢軸的精密調(diào)控，其主要通過(guò)GnRH對(duì)LH和卵泡刺激素（follicle-simulating hormone，F(xiàn)SH）分泌的調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)［2-4］。但是，甾體避孕藥對(duì)生殖過(guò)程的影響是綜合性的，由于PRL水平的升高能使生殖機(jī)能減退。Shaaban等［7］發(fā)現(xiàn)使用Norplant埋植劑的婦女，半年后血清PRL升高。而Diaz等［8］對(duì)使用Norplant埋植劑婦女的血清PRL進(jìn)行了縱向比較，并未發(fā)現(xiàn)顯著差異。Spellacy等［9］觀察到釋放低劑量孕酮IUD可顯著提高PRL水平，而含銅IUD卻無(wú)此作用。Mishell等［10］發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期和短期應(yīng)用復(fù)方或單純?cè)屑に乇茉兴幍膵D女，血清PRL水平升高。但也有學(xué)者［11］觀察到，低劑量雌二醇配伍L(zhǎng)NG或地索高諾酮的復(fù)方片不影響血清PRL水平。迄今為止，這項(xiàng)研究仍未取得一致的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)中觀察到，大鼠應(yīng)用LNG后，長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)組大鼠血清PRL升高，考慮PRL的升高參與了LNG對(duì)下丘腦-垂體-卵巢軸的調(diào)控作用。事實(shí)上，有報(bào)道［12］PRL可通過(guò)中樞及卵巢2條途徑，對(duì)下丘腦-垂體-卵巢軸功能產(chǎn)生影響。PRL可作用于下丘腦-垂體軸，調(diào)控FSH的基因表達(dá)；高水平PRL可通過(guò)短路反射刺激下丘腦分泌多巴胺增多，抑制下丘腦GnRH的合成與釋放，LH分泌下降，使機(jī)體不能形成排卵前的雌激素高峰和LH峰，并直接抑制卵巢合成雌二醇和孕酮，干擾受精和胚胎發(fā)育［13-15］。LNG是第2代全合成孕激素類藥物，為19-去甲基-睪酮的衍生物，19位甲基被取代，17位增加乙炔基，是強(qiáng)有力的孕激素。本實(shí)驗(yàn)中觀察到，大鼠應(yīng)用LNG后，長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)組大鼠垂體PRL細(xì)胞變大、數(shù)量增多。電鏡下可見(jiàn)到胞漿內(nèi)分泌顆粒減少，高爾基復(fù)合體發(fā)達(dá)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，常呈同心圓排列。如此結(jié)果表明，PRL合成、分泌旺盛，使血清PRL濃度升高，這可能對(duì)抑制大鼠排卵起一定的作用。但是，由于基礎(chǔ)PRL血清濃度的波動(dòng)范圍很大，并且其分布趨向于右斜，如果取血時(shí)間不同，加之實(shí)驗(yàn)對(duì)象年齡、種屬的不同以及避孕藥物組成和劑量的差異，都會(huì)使情況趨于復(fù)雜化，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。本實(shí)驗(yàn)觀察到停藥后，大鼠PRL細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞分布與大小，都逐漸接近正常情況，血清激素濃度也逐步恢復(fù)正常水平。我們認(rèn)為，應(yīng)用LNG對(duì)腺垂體細(xì)胞形態(tài)和內(nèi)分泌活動(dòng)的影響是暫時(shí)的，停藥后可恢復(fù)正常。實(shí)際上，長(zhǎng)期應(yīng)用避孕藥的婦女，在停藥后能恢復(fù)生育能力，這在臨床上已得到驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)從形態(tài)學(xué)等方面，進(jìn)一步驗(yàn)證了這類藥物的可恢復(fù)性。（本文圖見(jiàn)封二）

［1］ KRIKUN G，BOOTH CJ，BUCHWALDER L，et al.Long-term progestin-only contraception in humans versus animal models［J］.Ann N Y Acad Sci，2011，1221（3）：119-123.

［2］ 崔慧先，劉曉云，康林，等.左旋18-甲基炔諾酮對(duì)大鼠下丘腦GnRH神經(jīng)元的影響［J］.解剖學(xué)雜志，2005，28（2）：182-184.

［3］ 劉曉云，崔慧先，劉力斗，等.LNG對(duì)大鼠下丘腦內(nèi)NPY神經(jīng)元的影響［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2006，26（11）：1266-1267.

［4］ 黎海莉，杜鵑，劉雅坤，等.左旋18-甲基炔諾酮對(duì)大鼠大鼠垂體黃體生成素細(xì)胞形態(tài)及血清濃度的影響［J］.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，33（5）：497-500.

［5］ WRIGHT KP，JOHNSON JV.Evaluation of extended and continuous use oral contraceptives［J］.Ther Clin Risk Manag，2008，4（5）：905-911.

［6］ SIVIN I.Risks and benefits，advantages and disadvantages of levonorgestrel-releasing contraceptive implants［J］.Drug Saf，2003，26（5）：303-335.

［7］ SHAABANMM，GHANEIMAH SA，GOMAAAA，etal.Hormonal changes during the first year of use of subdermal levonoregestrel implants Norp lant［J］.Contraception，1984，30（5）：391-405.

［8］ DIAZ S，PAVEZM，BRANDEISA，et al.A longitudinal study on cortisol，prolactin and thyroid hormones in users of Norplant subdermal implants or a copper T device［J］.Contraception，1989，40（4）：505-517.

［9］ SPELLACY WN，BUHI WC.A prospective study of plasma prolactin levels in women using the progesterone releasing intrauterine device（P-IUD）［J］.Contraception，1979，19（1）：91-94.

［10］ MISHELL DR JR，KLETZKY OA，BRENNER PF，et al.The effect of contraceptive steroids on hypothalamic-pituitary function［J］.Am JObstet Gynecol，1977，128（1）：60-74.

［11］ SCOTT JZ，KLETZKY OA，BRENNER PF，et al.Comparison of the effects of contraceptive steroid formulations containing two doses of estrogen on pituitary function［J］.Fertil Steril，1978，30（2）：141-145.

［12］ CRAWFORD JL，MESTER B，THOMSON B，et al.Prolactin acts on the hypothalamic-pituitary axis to modulate folliclestimulating hormone gene expression in the female brushtail possum［J］.Gen Comp Endocrinol，2011，171（1）：39-45.

［13］ EGLI M，LEENERS B，KRUGER TH.Prolactin secretion patterns：basic mechanisms and clinical implications for reproduction［J］.Reproduction，2010，140（5）：643-54.

［14］ BERNICHTEIN S，TOURAINE P，GOFFIN V.New concepts in prolactin biology［J］.JEndocrinol，2010，206（1）：1-11.

［15］ BONAFEDE MM，VALDEZ SR，ARBOCC?FC，et al.Effect of progesterone withdrawal on hypothalamic mechanisms related to prolactin release in late pregnant rats［J］.Neuroendocrinology，2011，94（2）：148-57.

（本文編輯：劉斯靜）

THE EFFECTSOF PROGESTIN-ONLY CONTRACEPTION ON THE PRL LEVEL AND THE MORPHOLOGICAL CHANGE OF THE PITUITARY PRL CELLS IN RATS

LIHaili1，PAN Ying2，SHENWei1，DU Juan2，KANG Lin2*，CUIHuixian2
（1.Department of Obstetricsand Gynecology，the Fourth Hospital of HebeiMedical University，
Shijiazhuang 050011，China；2.Departmentof Anatomy，the School of Basic Medical Sciences，HebeiMedical University，Shijiazhuang 050017，China）

ObjectiveTo investigate the morphological alternations of prolactin（PRL）cells and the serum concentrations of PRL in levonorgestrel（LNG）-treated rats.MethodsThe normal female SD ratswere divided into long-term treated group and drug withdrawal group.The pituitary PRL cells were identified by immunohistochemistry and transmission electron microscope（TEM）method.The serum concentrations of PRL were measured by IMMULITE automated analyzer.ResultsIn long-term treated group，the number andmean areas of PRL cells increased（P＜0.01，P＜0.05）and the shape became irregular.Golgi complex and rough endoplasmic reticulum became very developed and the secretory granules with various size and shape decreased.The serum concentrations of PRL were significantly higher in treated group than those of control group（P＜0.01）.After drug-withdrawal，these observation indexes recovered to normal gradually.ConclusionLNG causes changes ofmorphology of PRL cells and concentrations of PRL，but these changes can return to normal after ceasing treatment.The antiovulation of LNG is various and complex and involve in the increase of the serum concentrations ofPRL.

contraceptives，oral，hormonal；pituitary gland；prolactin；rats

R979.21

A

1007-3205（2012）06-0621-04

2012-05-19；

2012-05-31

河北省科技廳博士基金課題（04547002D-3）

黎海莉（1974-），女，河北邯鄲人，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事生殖內(nèi)分泌疾病以及婦科腫瘤診治研究。

*通訊作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.06.001