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蛋白質(zhì)組學(xué)在肺癌與肺結(jié)核病鑒別診斷中的研究進(jìn)展

2012-04-07 11:15:20張雙林孫明飛宋言崢
關(guān)鍵詞:組學(xué)積液質(zhì)譜

張雙林,孫明飛,宋言崢

(1.河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院 胸心血管外科,河南 開封 475000;2.復(fù)旦大學(xué) 附屬公共衛(wèi)生臨床中心,上海 200540)

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一。近年來,發(fā)病率在世界各國呈上升趨勢,其病死率位居惡性腫瘤首位。由于HIV傳播及抗生素耐藥率不斷上升,肺結(jié)核病在全球死灰復(fù)燃。肺結(jié)核、肺癌都屬于呼吸系統(tǒng)疾病,具有相似的臨床癥狀。目前,肺結(jié)核特別是菌陰肺結(jié)核與肺癌的鑒別診斷仍是一大難題?,F(xiàn)有的鑒別診斷方法很多,但效果不一,都存在局限性。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)及其發(fā)展為2種疾病的診斷標(biāo)志物的研究提供了新的方法及思路,未來可能為2種疾病的診斷及鑒別診斷提供新的技術(shù)手段。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)概念及研究內(nèi)容

1994年澳大利亞的 Wikins和 Williams[1]在意大利提出了蛋白質(zhì)組(proteome)這一概念,其意指“一種基因組所表達(dá)的全套蛋白質(zhì),即包括一種細(xì)胞、一種組織全部蛋白質(zhì)”。它的最大優(yōu)勢是可以在同一個實驗中,觀察一個完整的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞型在特定的時間下,生理或病理狀態(tài)中所發(fā)生的相應(yīng)的變化[2]。近年來,隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展,已發(fā)現(xiàn)一批有價值的潛在標(biāo)志物,為疾病的診斷和治療開辟了新的途徑[3-4]。

蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究內(nèi)容是:①表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué):即研究蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)與量的變化,以及對蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜的分析研究。②功能蛋白質(zhì)組學(xué):即研究蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的行為、運輸以及蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。③結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué):為了闡述蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征,而出現(xiàn)的一種全景式的蛋白質(zhì)組學(xué)研究,可獲得有機(jī)體生命活動的全景式認(rèn)識。蛋白質(zhì)組學(xué)的深入研究能更深入地了解疾病發(fā)生的分子機(jī)制,同時也能為疾病的預(yù)防、臨床診斷及治療提供新思路。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)常用技術(shù)

2.1 蛋白質(zhì)樣品制備

蛋白質(zhì)樣品制備至今沒有一個通用的技術(shù)。在制備樣品時,首先要明確實驗的最終目的,然后結(jié)合實驗積累的經(jīng)驗來選取制備方法。

蛋白質(zhì)樣品制備的原則:①制備的樣品要全部處于溶解狀態(tài)。②在制備樣品時防止發(fā)生聚集、沉淀。③完全去除干擾蛋白(高豐度及無關(guān)蛋白)。④制備方法要具有可重復(fù)性。而制備蛋白質(zhì)樣品的同時要特別注意去除高豐度蛋白(血清蛋白、免疫球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、珠蛋白、脂蛋白等)[5]。去除高豐度蛋白方法很多,應(yīng)根據(jù)實驗?zāi)康倪x取。例如:親和層析技術(shù)[6]、沉淀法[7]、超濾離心法[8]、等電捕捉法[9]、液相色 譜法[10]等。而理想的去除高豐度蛋白的方法是:既能最大限度地去除高豐度蛋白又能避免影響低豐度蛋白。因此,要根據(jù)不同的實驗及其目的選擇不同的方法。

2.2 雙向凝膠電泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)

雙向凝膠電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的經(jīng)典方法之一。1975年,O’Farrell[11]首次建立等電聚焦/SDS-聚丙烯酰胺雙向凝膠電泳(IEF/SDS-PAGE)的模式,其基本原理為,第一向電泳:蛋白質(zhì)在pH梯度內(nèi)按照它們等電點的不同進(jìn)行分離;第二向電泳:在垂直方向上按照蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量大小進(jìn)行SDSPAGE電泳分離。直到20世紀(jì)80年代中期出現(xiàn)了“固相pH梯度”,克服了載體兩性電解質(zhì)陰極漂移、梯度不穩(wěn)定等缺點,從而大大提高了分辨率。但是,2-DE依然存在缺陷:①分離蛋白質(zhì)數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于人類基因組數(shù)所表達(dá)蛋白質(zhì)。②不易分離分子量大于200KD或小于10KD的蛋白質(zhì)。③不易分離疏水蛋白、膜蛋白、低豐度蛋白。④不易分離極酸或極堿蛋白。所以 “2-DE是否已過時?”也反復(fù)的被提出。迄今,許多人努力尋找替代2-DE的方法,促進(jìn)了其他的蛋白質(zhì)分離、分析技術(shù)的出現(xiàn)。例如:“液相色譜技術(shù)”在一定程度上克服了2-DE的缺陷,與2-DE比較,液相色譜技術(shù)在對分離疏水蛋白及膜蛋白等方面上具備獨特的優(yōu)勢[12]。然而這種技術(shù)卻不足以替代具有高分辨能力的、成熟技術(shù)路線的2-DE。

總的來講,鑒于蛋白質(zhì)的豐度和性質(zhì)的多樣性,不可能僅用一種分離技術(shù)就能應(yīng)對所有的蛋白質(zhì)組分析的需求。因此,多項技術(shù)互補(bǔ)性應(yīng)用在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中不可忽視。

2.3 質(zhì)譜技術(shù)

1912年,英國物理學(xué)家Joseph John Thomson研制出第一臺質(zhì)譜儀。但直到20世紀(jì)40年代,質(zhì)譜技術(shù)才廣泛應(yīng)用于有機(jī)物質(zhì)的分析。20世紀(jì)80年代“四大軟電技術(shù)”的出現(xiàn),讓質(zhì)譜技術(shù)從此邁入生物質(zhì)譜時代。常用的質(zhì)譜技術(shù)主要有:①電噴霧質(zhì)譜技術(shù)(ESI-MS)[13]:基本原理是毛細(xì)管出口處所產(chǎn)生的高壓把毛細(xì)管流出的液體霧化成帶電荷的小液滴。隨著溶劑蒸發(fā),液滴表面電荷強(qiáng)度越來越大,最終液滴變成帶有大量一個或者多個電荷的離子,致使分析物質(zhì)以電荷形式進(jìn)入氣相。其特點為,通過產(chǎn)生的高電荷離子,使質(zhì)量/電荷降低到多數(shù)質(zhì)量分析儀器可以檢測的范圍,所以ESI-MS大大提高了分析范圍。②基質(zhì)輔助激光解吸吸附質(zhì)譜技術(shù)(MALDIMS)[14]:基本原理是將分析的物質(zhì)分散在基質(zhì)分子中并形成晶體。當(dāng)用激光照射晶體時,由于基質(zhì)分子經(jīng)輻射吸收大量的能量,基質(zhì)分子因能量蓄積而迅速產(chǎn)熱,從而使基質(zhì)晶體升華,致使基質(zhì)和分析物膨脹并進(jìn)入氣相。MALDI常與TOF聯(lián)合使用,而TOF可檢測的分子質(zhì)量沒有上限,因此,MALDI-TOFMS適合對核酸、多肽、蛋白質(zhì)及多糖的檢測。③表面增強(qiáng)激光解析離子化/飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(SELDITOF-MS):該技術(shù)是由 MALDI-TOF發(fā)展而來的,是一項蛋白芯片技術(shù)。其基本原理是待測樣品與有廣泛結(jié)合特性的芯片結(jié)合,然后直接進(jìn)入MALDITOF的檢測。它的開展解決了以往蛋白質(zhì)研究中費力、耗時、不適合臨床大規(guī)模篩查的弊端。

目前質(zhì)譜技術(shù)已成為測定生物大分子(蛋白質(zhì)、多肽、多糖等)的有效工具,也是蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù)之一[15]。

3 肺癌與肺結(jié)核的蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展,肺癌與肺結(jié)核的診斷及鑒別診斷無論從方法多樣性或檢出率上都有了很大的改觀。但至今仍未找到一種快速、特異、廉價、高效的方法去鑒別兩種疾病。目前只能靠多種檢查來綜合判定,最可靠的方法是病理組織活檢及細(xì)菌學(xué)檢查。然而病理組織活檢創(chuàng)傷較大、細(xì)菌學(xué)檢查時間長,檢出率低等,都直接制約了兩種疾病的鑒別效果,同時也阻礙了臨床早期治療。近年來,蛋白質(zhì)組學(xué)的出現(xiàn)及發(fā)展,為兩種疾病的研究提供了新的平臺。從蛋白質(zhì)水平揭示兩種疾病的相關(guān)性及差異性,為兩者的鑒別診斷研究奠定了基礎(chǔ)。

3.1 蛋白質(zhì)指紋圖譜診斷模型的鑒別診斷價值

蛋白質(zhì)指紋圖譜診斷模型是最佳的蛋白峰組合,其檢測靈敏度、特異度都要高于單一蛋白質(zhì)診斷效率,具有一定的診斷及鑒別診斷價值,對肺癌及肺結(jié)核的診斷及鑒別診斷有著潛在的研究價值。王琳等[16]收集肺結(jié)核、肺癌患者及正常人的血清標(biāo)本各65例,采用WCX2芯片技術(shù)對血清蛋白進(jìn)行捕獲,用蛋白芯片閱讀器PBSⅡ?qū)π酒M(jìn)行分析比較,65例活動性肺結(jié)核與65例肺癌患者的血清蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯 示:4 個 蛋 白 峰 (5335m/z、8048m/z、11700m/z、11683m/z)傾向于肺結(jié)核(P<0.01),該診斷模型判別的總準(zhǔn)確率為74.6% (97/130),靈敏度80.0%(52/65),特異度69.2% (45/65)。而Liu等[17]收集了87位結(jié)核病患者(51位涂片陽性、36位涂片陰性)、68位非結(jié)核病患者(55位健康人、13位其他呼吸系統(tǒng)疾病),用SELDI-TOF-MS分離血清蛋白質(zhì),并得到血清蛋白質(zhì)的指紋圖譜,最終選定9個質(zhì)譜峰建立診斷模型,并對測試組檢測,診斷準(zhǔn)確率為80%;聚類分析顯示:m/z 4821.45,4792.74分辨涂片陰性結(jié)核患者和對照組的準(zhǔn)確度為81.59%。

3.2 標(biāo)志物的鑒別診斷價值

標(biāo)志物的檢測具有快速、高效、廉價等優(yōu)點,可提高臨床診斷的效率,也是鑒別診斷的理想指標(biāo)。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)尋找疾病特異的標(biāo)志物,可為研究疾病的早期診斷及兩種疾病的鑒別診斷提供新的思路。

Liu等[18]對227例血清樣品(146例肺癌、13例肺炎、28例結(jié)核性胸膜炎和40例正常人血清樣品)進(jìn)行蛋白質(zhì)譜檢測,鑒定出3個能把肺癌組與肺炎組、結(jié)核性胸膜炎組、正常人組區(qū)分開來得差異蛋白。質(zhì)譜鑒定這3個差異蛋白峰分別為“野生型甲狀腺運載蛋白”以及它的兩個變體。Chen[19]運用蛋白組學(xué)技術(shù)對“非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCL-H266”和“腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系 H226BR”的分泌蛋白對比研究中,發(fā)現(xiàn)了LDHB在非小細(xì)胞肺癌患者血清中的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于結(jié)核患者、肺炎患者和正常人的血清中的表達(dá)水平。林全[20]通過2-DE、MALDI-TOF-MS對癌性胸腔積液及結(jié)核性胸腔積液的差異蛋白進(jìn)行了比較研究,其中有9個點僅在結(jié)核性胸腔積液表達(dá),11個點僅在肺癌胸腔積液中表達(dá),最終選取差異顯著的10個點進(jìn)行質(zhì)譜分析,成功鑒定了6個蛋白質(zhì)。Rodriguez-Pineiro等[21]利用2-DE和質(zhì)譜技術(shù)分別從“非小細(xì)胞肺癌和肺炎病人的血清水平”、“非小細(xì)胞肺癌和肺結(jié)核病人的胸腔積液水平”進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)PEDF在非小細(xì)胞肺癌患者的血清和胸腔積液中的表達(dá)高于結(jié)核患者與肺炎患者組;而凝溶膠蛋白和金屬蛋白酶抑制劑2在非小細(xì)胞肺癌的胸腔積液中表達(dá)高于結(jié)核患者胸腔積液、S100-A8和S100-A9在非小細(xì)胞肺癌的胸腔積液中處于低表達(dá)。He等[22]應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)了一種新的非小細(xì)胞肺癌的腫瘤抗原α-烯醇酶,并聯(lián)合ELISA方法檢測α-烯醇酶的自身抗體,發(fā)現(xiàn)α-烯醇酶在非小細(xì)胞肺癌組中自身抗體陽性率較高,為27.65%。而其他肺部疾?。òńY(jié)核?。﹥H在正常對照組發(fā)現(xiàn)了1例。

4 展望

在同一疾病不同發(fā)展階段或不同疾病,其蛋白質(zhì)表達(dá)往往存在差異,這些差異蛋白可能與該疾病的發(fā)生和發(fā)展有直接或間接的關(guān)系[23],也可根據(jù)這些差異蛋白對疾病進(jìn)行診斷及鑒別診斷[24]。目前,在蛋白組學(xué)水平上對兩種疾病的鑒別診斷研究還較少。但是,不論那種疾病的特異性標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)都將會對兩種疾病的診斷及鑒別診斷做出巨大貢獻(xiàn)。如今蛋白質(zhì)組學(xué)已被廣泛應(yīng)用于各種疾病及同一疾病不同層面的研究。未來對肺癌及肺結(jié)核的鑒別診斷研究將會成為新的研究方向,也必將為兩種疾病的診斷和個體化治療提供新型技術(shù)手段。

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