沈倍奮

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850）

抗體藥物以其與靶抗原結(jié)合的高特異性、有效性和安全性，在臨床惡性腫瘤、自身免疫病等重大疾病的治療中取得突破，發(fā)展迅速，是當(dāng)前生物藥中復(fù)合增長率最高的一類藥物，成為生物制藥產(chǎn)業(yè)的領(lǐng)頭羊。至今，美國FDA批準了34個抗體藥物和6個Fc融合蛋白。2010年銷售前10位的生物藥中單抗有7個，分別是Enbrel、貝伐單抗（bevacizumab，Avastin）、利妥昔單抗（rituximab，Rituxan）、阿達木單抗（adalimumab，Humira）、英 利 昔 單 抗 （infliximab，Remicade）、曲妥珠單抗（trastuzumab，Herceptin）和Lucentis。由于單抗藥物具有巨大的經(jīng)濟效益和社會效益，是目前生物制藥產(chǎn)業(yè)中最重要的研究領(lǐng)域，也是各國爭相競爭的焦點。

抗體藥物的發(fā)展經(jīng)歷了鼠源性抗體、人源化抗體和全人抗體三個階段。人源化及全人抗體近年來發(fā)展迅速，在FDA批準的抗體藥物中已占80%以上，人源化及全人抗體以其低排斥反應(yīng)等優(yōu)點成為抗體藥物發(fā)展的主要趨勢。

抗體雖然是一個天然分子，但作為治療用藥物必須滿足生物制劑的各項要求，如：親和力、Koff、特異性、穩(wěn)定性、溶解度、聚合度、表達水平和功能等。因此，得到一個抗體基因，并不是表達后就能成為藥物，必須要對其進行改造，使其符合上述要求。我國抗體藥物產(chǎn)業(yè)化的瓶頸主要在兩個方面，上游的瓶頸是：在獲得人源化或人源抗體后的抗體親和力提高、效應(yīng)功能提高、抗體表達量提高。中下游的瓶頸是：在什么樣的培養(yǎng)條件下保持細胞活力、抗體分泌量和高密度生長。要解決這兩方面的問題需要多種技術(shù)的整合，也需要上、中、下游的緊密合作才能實現(xiàn)。目前在這兩方面的主要進展如下。

1 抗體人源化改造

最早出現(xiàn)的人源化抗體是人－鼠嵌合抗體，由鼠抗體可變區(qū)基因片段連接到人抗體恒定區(qū)基因上獲得。一般嵌合抗體的人源化程度可達70%，大大降低了鼠抗體的免疫原性，而保持了親本抗體的特異性和親和力，例如美國FDA批準的ReoPro、Rituxan、Remicade、Simulect、Synagis和Erbitux等。嵌合抗體在臨床應(yīng)用中已被證明是安全的，但不能完全消除人抗鼠反應(yīng)（HAMA）。

進一步人源化的方法很多，最早是CDR移植，將鼠抗體的CDR移植到人抗體的相應(yīng)部位，這樣人源化程度可達90%以上。簡單的CDR移植往往會明顯降低抗體的親和力，甚至喪失與抗原結(jié)合的能力；在CDR移植的同時，將一些支撐CDR loop構(gòu)象的鼠Ig框架區(qū)氨基酸也進行移植，可有效保持親本鼠抗體的親和力和特異性。另一種常用的人源化方法是表面重塑技術(shù)，即鼠抗體框架區(qū)表面氨基酸的“人源化”，具體是通過鼠和人抗體可變區(qū)立體構(gòu)象疊合比對，尋找合適的人抗體模板，將鼠Fv段表面暴露的框架區(qū)殘基中與人Fv不同的改為人源的氨基酸，達到鼠Fv的表面殘基人源化，降低免疫原性；由于該方法不影響Fv的整體空間構(gòu)象，所以獲得的抗體仍保留與抗原的結(jié)合能力。

Dallacgua WF提出框架改組（framework shuffling）的方法進行抗體人源化改造，主要是將鼠抗體的6個CDR區(qū)以正確的讀框融合到人Ig胚系框架中，構(gòu)建成庫，用相應(yīng)抗原篩庫，由于篩出的抗體框架來源于相匹配的CDR序列和結(jié)構(gòu)，因此它保留了與抗原的最好結(jié)合，這種抗體接近于天然的全人抗體。如果抗原有晶體結(jié)構(gòu)，則可以采用特異性決定基（specificity determining residues，SDR）移植的方法，該方法首先需要分析待改造抗體的結(jié)合位點，或通過抗原－抗體復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)確定抗體高變區(qū)中與抗原結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸，然后將這些決定特異性的關(guān)鍵氨基酸移植到相匹配的人抗體相應(yīng)位置上。

去免疫原性是一項專門的平臺技術(shù)，包括確定和去除鼠抗體上能被人T細胞識別的表位，這樣的治療性抗體不再激活T細胞反應(yīng)和以后的HAMA反應(yīng)，如Biovation技術(shù)。迄今為止，經(jīng)不同人源化方法改造的上市抗體有：Zenapax、Herceptin、Mylotarg、Campath、Xolair、Raptiva、Avastin、Tysabri、Actemra等。

2 人源抗體制備技術(shù)

目前人源抗體制備技術(shù)包括：人－人雜交瘤技術(shù)、EB病毒轉(zhuǎn)化人B淋巴細胞、抗體庫技術(shù)和轉(zhuǎn)基因鼠技術(shù)，最常用的是抗體庫技術(shù)和轉(zhuǎn)基因鼠技術(shù)。

20世紀90年代，抗體庫技術(shù)的出現(xiàn)為抗體人源化和人源抗體的制備開辟了新途徑。該技術(shù)在體外模擬了抗體的體內(nèi)成熟過程，從B淋巴細胞中擴增全套抗體的輕鏈和重鏈基因，克隆到特定載體上，使抗體展示于噬菌體表面，構(gòu)成噬菌體抗體庫（Phage Antibody Library），庫容一般在107左右；用抗原篩選出表達相應(yīng)抗體的噬菌體，經(jīng)擴增、測序可獲得特異性抗體基因。如果B細胞來源于人外周血，則可得到全人抗體。噬菌體表面展示技術(shù)的優(yōu)點是可以直接得到人源抗體，不需要經(jīng)過免疫系統(tǒng)和免疫步驟，避免了鼠抗體的人源化改造過程，但得到的抗體往往親和力較低，需要在體外對抗體的親和力和特異性進行改造。用該方法獲得的上市抗體有Humira、Vectibix等。

抗體庫的質(zhì)量（多樣性和親和力）與抗體庫的庫容量成正比。為了獲得高親和力的抗體，往往需要大容量抗體庫。因此，人們在噬菌體抗體庫的基礎(chǔ)上，引入Cre－loxP體內(nèi)重組系統(tǒng)，一個細菌同時被多個噬菌體感染后發(fā)生重組，通過這種方式，可以得到庫容大于1011的抗體庫。

抗體基因除了展示在噬菌體表面，也可以展示在酵母、細菌表面和核糖體上。特別是核糖體展示技術(shù)，由于噬菌體抗體庫需要通過生物體轉(zhuǎn)化，受轉(zhuǎn)化效率的影響，一般庫容不大。近年來利用RNA技術(shù)進行的抗體基因核糖體展示不需要通過生物體轉(zhuǎn)化的過程，它完全在體外無細胞體系中進行，不涉及活細胞、載體、噬菌體，從而避免了文庫導(dǎo)入細胞所必需的轉(zhuǎn)化步驟帶來的轉(zhuǎn)化效率的限制。因此，它有2個突出優(yōu)點：①抗體文庫的多樣性不受細菌轉(zhuǎn)化效率的限制，有可能達到1014這樣大的庫容；②核糖體展示技術(shù)的方案中有許多PCR擴增步驟，易發(fā)生突變，因此，很容易引入進化機制。

構(gòu)建抗體庫涉及到的一個重要因素，就是抗體基因的來源。抗體庫的抗體基因，既可來源于人或動物的外周血淋巴細胞、骨髓、脾細胞等生物體，也可以是通過基因合成獲得（合成抗體庫）；同時，也可以在一個抗體庫中，既有生物來源的抗體基因，又含有合成的抗體基因（半合成抗體庫）。由于人抗體基因的保守性，德國Morphosys公司對人類抗體胚系基因及所有重排序列進行分組，其中95%以上序列可歸為14個亞組：7個重鏈VH亞組（VH1A，VH1B，VH2，VH3，VH4，VH5，VH6），4個 Vκ亞組（Vκ1，Vκ2，Vκ3，Vκ4）和3個 Vλ亞組（Vλ1，Vλ2，Vλ3），亞組中的每個成員之間都有高度的同源性。因此，可以設(shè)計合成14個亞組各自通用的基因，作為構(gòu)建組合抗體庫（combinatorial antibody library）的主干基因，由此組合而成的抗體庫稱合成抗體庫。與生物來源的抗體庫相比，合成抗體庫的優(yōu)點在于庫的內(nèi)容、位點變異性及庫的整體多樣性均可操作和控制。在合成過程中可以在各種元件兩側(cè)引入合適的限制性內(nèi)切酶位點，便于進行基因操作，如：將輕、重鏈的CDR區(qū)設(shè)計成兩側(cè)帶有酶切位點的盒式結(jié)構(gòu)，便于替換。也可以引入大腸桿菌偏性密碼，使其在大腸桿菌中高效表達。由于載體和抗體基因的模式設(shè)計及模塊性操作使得單鏈抗體（scFv）能夠通過簡單的克隆步驟，快速切換成不同的微抗體形式，如二硫鍵聯(lián)接Fv片段、Fabs、免疫毒素或多價結(jié)構(gòu)的抗體。

抗體庫都需要經(jīng)過篩選才能獲得我們需要的特異性抗體。常規(guī)篩選抗體庫的方法是用一個抗原通過類似親和層析的方法，從抗體庫中將與之結(jié)合的抗體“釣”出來，由此衍生出多種抗體庫的篩選方法。但從抗體庫中獲得的抗體往往親和力不高，需要進行親和力成熟的改造。

抗原表位定向選擇（epitope guided selection）是利用抗體庫技術(shù)進行鼠抗體人源化的又一種方法。將鼠抗體的輕鏈或重鏈文庫，與人抗體的重鏈或輕鏈文庫配對構(gòu)建成“人－鼠雜合抗體庫”，篩選與抗原結(jié)合的克隆，分離獲得人抗體的重鏈或輕鏈基因，再將它們與人的輕鏈或重鏈文庫混合，用抗原篩選，就能得到與抗原結(jié)合的特異性人抗體。

另一個制備人源抗體的有效方法是利用轉(zhuǎn)基因鼠，該鼠敲除了鼠源免疫球蛋白基因組，而轉(zhuǎn)入人免疫球蛋白基因組。這種小鼠的B細胞在分化成熟的過程中，以及成熟的B細胞在針對某個抗原進行抗體反應(yīng)時，所使用的抗體基因是轉(zhuǎn)入的人源抗體的基因。因此，用抗原免疫后可產(chǎn)生高滴度的人抗體。轉(zhuǎn)基因鼠技術(shù)解決了抗體庫技術(shù)中抗體親和力不高的問題。

隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)、計算生物學(xué)、生物信息學(xué)、計算機科學(xué)的迅速發(fā)展，借助已有的抗原／抗體序列、結(jié)構(gòu)信息以及抗原—抗體相互作用模式分析，合理確定功能抗體識別的靶位（即抗體藥物的靶點），并進而應(yīng)用計算機輔助分子設(shè)計理論、高通量虛擬篩選技術(shù)開展抗體模擬物（包括高親和力人源抗體）的從頭設(shè)計成為研究的熱點。

目前，基于抗原－抗體的作用復(fù)合物結(jié)構(gòu)開展抗體模擬物的從頭設(shè)計研究尚處于起步階段，設(shè)計的成功與否與靶抗原的結(jié)構(gòu)、抗原－抗體復(fù)合物結(jié)構(gòu)以及藥效團構(gòu)象有著密切的聯(lián)系。然而，由于該方法回避了雜交瘤技術(shù)、抗體人源化技術(shù)、抗體庫技術(shù)等，必將有著廣泛的應(yīng)用前景。

3 提高抗體親和力

經(jīng)過抗原多次刺激，B細胞克隆產(chǎn)生的抗體親和力越來越高。然而體內(nèi)親和力成熟往往仍達不到抗體靶向治療的要求，因此，需要在體外進行抗體親和力成熟?，F(xiàn)在已有很多方法可模擬體內(nèi)抗體親和力成熟的方式，在體外進行抗體親和力成熟。

3.1 CDR區(qū)突變

CDR區(qū)突變是一種模擬體內(nèi)體細胞突變的方法，它包括定向誘導(dǎo)突變和隨機誘導(dǎo)突變，前者需要對抗原－抗體相互作用的立體結(jié)構(gòu)有很好了解的情況下采用，否則成功率不高，而隨機突變通過引進隨機的堿基替換，進而篩選理想的突變體。易錯PCR技術(shù)是一種引入突變的簡便方法。

3.2 鏈替換（chain shuffling）

根據(jù)抗體可變區(qū)隨機配對的原理，將抗體的一條鏈保持不變，替換另一條鏈，然后用抗原進行篩選，重復(fù)進行鏈替換和親和力篩選，將產(chǎn)生高親和力的抗體。

3.3 分子展示（molecular display）技術(shù)

包括噬菌體展示、細菌展示、酵母展示、核糖體展示和mRNA展示等。它們各具特點，都可以用于抗體等蛋白質(zhì)的親和力提高，其基本原理是將抗體基因編碼的抗體蛋白展示出來，通過抗原選擇，獲得親和力提高的抗體。

3.4 基于計算機設(shè)計提高抗體親和力

目前，基于計算機輔助設(shè)計提高抗體親和力的方法主要從構(gòu)象、能量兩個方面考慮?；谟嬎銠C輔助設(shè)計提高抗體親和力的方法減少了實驗的盲目性，然而，設(shè)計的成功與否要依賴于抗原－抗體相互作用動態(tài)模式、界面構(gòu)象特征的合理判定，因此，在抗原或抗原－抗體作用復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)已知的情況下成功率較高。

4 提高抗體效應(yīng)功能

治療性抗體的作用機制有多種，主要可歸為2個基本類型：一類是依賴于它們的抗原結(jié)合功能，例如抗體與抗原結(jié)合后阻斷或中和靶分子的生物學(xué)活性、利用抗體的靶向性，將細胞毒性物質(zhì)導(dǎo)向到靶部位、抗體與細胞膜抗原結(jié)合后誘發(fā)信號傳導(dǎo)的改變，引起細胞凋亡等；另一類除與它們的抗原結(jié)合能力有關(guān)外，還與抗體的Fc結(jié)構(gòu)有關(guān)，如激發(fā)ADCC和CDC效應(yīng)，因此改進抗體與FcγRs或補體的結(jié)合，可以提高它們的治療效果。根據(jù)上述作用機制，可針對性地對治療性抗體進行改造，提高其效應(yīng)功能。

4.1 以抗體為導(dǎo)向載體的免疫結(jié)合物（Immunocojugate）

免疫結(jié)合物是以抗體或抗體片段為載體連接放射性核素、藥物或毒素構(gòu)成。這些細胞毒性物質(zhì)大大增強了抗體殺傷靶細胞的能力。2011年美國FDA批準的Brentuximab vedotin（Adcetris）就是抗體與monomethyl auristatin E的化學(xué)偶聯(lián)物。

4.2 免疫細胞因子（immunocytokines）

抗體與細胞因子基因連接后表達的融合蛋白稱免疫細胞因子，它可將抗體的特異性與細胞因子的有效免疫刺激活性有機結(jié)合起來。

4.3 雙特異性抗體

雙特異性抗體亦稱雙功能抗體，是同一抗體的2個抗原結(jié)合部位分別針對2個不同的抗原。因此，可以同時與2種抗原發(fā)生反應(yīng)，并使之交聯(lián)，因此雙特異性抗體可介導(dǎo)標記物或效應(yīng)分子與靶抗原的結(jié)合，更好地行使效應(yīng)分子的功能。

4.4 改造抗體的Fc增加ADCC和CDC效應(yīng)

抗腫瘤的治療性抗體的療效直接與抗體的ADCC和CDC效應(yīng)有關(guān)，前者是抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒作用，后者是補體依賴的細胞毒作用。上市抗體中Rituxan、Herceptin、Remicade等都有ADCC效應(yīng)，Rituxan和Campath－1有CDC效應(yīng)。當(dāng)抗體的Fc與NK細胞上的FcγRIIIa結(jié)合就激發(fā)ADCC效應(yīng)，改造抗體Fc使之提高與FcγR親和力是改進治療效果的方法之一。影響Fc與FcγR結(jié)合能力的因素有2個，一是FcγR上的氨基酸序列，另一個因素是Fc的糖結(jié)構(gòu)模式（glycoform），人IgG1－Fc連接的寡糖是雙觸角復(fù)合型的，具有一個核心結(jié)構(gòu)，核心結(jié)構(gòu)中有巖藻糖的抗體其ADCC效應(yīng)差，沒有巖藻糖的抗體其ADCC效應(yīng)明顯提高，巖藻糖的存在與否不影響抗體與抗原結(jié)合及CDC效應(yīng)。晶體結(jié)構(gòu)分析表明：人IgG1抗體Fc連接的寡糖是整合到Fc區(qū)域，并通過多個與CH2的非共價相互作用影響Fc構(gòu)型。因此，提高ADCC的策略是：①在抗體的Fc上經(jīng)合理設(shè)計進行氨基酸突變，表達出抗體后，進行功能比較，選擇ADCC效應(yīng)高的突變體；②去除抗體Fc連接的寡糖上的巖藻糖。減少巖藻糖的方法有2種：一種是細胞培養(yǎng)過程中進行培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化，改變糖基化途徑，達到抗體低巖藻糖化；另一種是將宿主細胞中的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因（如：FUT8基因）敲除。

抗體治療中的CDC效應(yīng)主要是抗體恒定區(qū)與補體C1q結(jié)合啟動的，提高CDC效應(yīng)的策略是：①突變恒定區(qū)的氨基酸，增強其與C1q的結(jié)合能力，提高CDC效應(yīng)，②將人IgG1和IgG3重鏈恒定區(qū)序列進行DNA改組（DNA shuffling），篩選出CDC活性高的組合。

提高抗體效應(yīng)功能的方法有很多，在進行抗體改造的時候，應(yīng)該有目的性地選擇單一的方法進行；盲目地將多種提高效應(yīng)功能的方法用于同一個抗體，則很難預(yù)測它們引起的構(gòu)型變化和生物活性變化。

5 抗體表達系統(tǒng)

目前完整抗體分子的表達需要用真核系統(tǒng)，如：酵母、昆蟲、植物和哺乳動物細胞系統(tǒng)。前三種系統(tǒng)由于其糖基化方式和類型與人類不同，一般用于臨床的治療性抗體不采用；而哺乳動物細胞表達系統(tǒng)能正確組裝成多亞基蛋白，表達的抗體與天然抗體的結(jié)構(gòu)、糖基化類型和方式幾乎相同；經(jīng)過馴化的哺乳動物細胞能以懸浮培養(yǎng)方式，在無血清培養(yǎng)基中高密度、大規(guī)模培養(yǎng)。與原核系統(tǒng)相比，哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的缺點是表達量低、生產(chǎn)成本高。為了提高表達量，多年來人們從表達載體、宿主細胞和培養(yǎng)工藝等多方面進行研究。用于治療性抗體表達的細胞系主要有SP2／0、NS0和CHO細胞。外源基因在真核系統(tǒng)中的表達受很多因素影響，如：整合目的基因的染色體區(qū)域的狀態(tài)、目的基因的拷貝數(shù)及目的基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后加工修飾的效率等。其中外源基因在基因組上整合的位置效應(yīng)尤為重要，它直接影響基因表達。因此，提高抗體基因在哺乳動物細胞中的表達，除了考慮啟動子、增強子、轉(zhuǎn)錄終止信號、多聚腺苷酸加尾信號等對轉(zhuǎn)錄水平高低及mRNA穩(wěn)定性的影響及優(yōu)化表達基因的密碼子外，還要重點關(guān)注位置效應(yīng)對基因表達的影響。

6 規(guī)?；毎囵B(yǎng)的進展

目前有幾百個抗體藥物正在開發(fā)，除了抗體片段外，都用哺乳動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，但抗體藥物的用量是其它生物藥的10～100倍，每年需要約3000～6000Kg。由于中下游的技術(shù)進展涉及制藥公司的機密，很少能得到公開資料。從大的方面看，以下幾方面值得關(guān)注：

6.1 優(yōu)化細胞培養(yǎng)

通過了解各種因素對細胞行為的影響，優(yōu)化培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件，提高產(chǎn)量和質(zhì)量。

6.2 細胞系改造

對于細胞系的改造日趨關(guān)注，主要集中在降低細胞凋亡、改善細胞活性，提高生長密度和產(chǎn)物表達量。

6.3 分析技術(shù)發(fā)展

過程分析技術(shù)的發(fā)展，實現(xiàn)實時過程分析和控制，細胞系的分析和篩選，糖基化和糖型的分析，以保證抗體藥物的質(zhì)量。

近幾年抗體藥物開發(fā)的新動向：①針對新抗原（靶分子）的抑制劑或激動劑，如 C5、IL－1β、IL－6R、TPO、IL12／23p40、EpCAMxCD3等；②出現(xiàn)第二代抗CD20和IL－1β抗體，第四代、第五代抗TNFα抗體或抗體衍生物；③抗體的新適應(yīng)癥，包括罕見疾病，如：治療陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿（PNH）、冷吡啉相關(guān)的周期性綜合征（CAPS）、免疫性血小板減少性紫癜（ITP）；④新的抗體形式，包括基因工程改造的Ig衍生物，如：IgG2／4、Fab－PEG、peptide－Fc、雙特異性／三特異性抗體、無海藻糖抗體等；⑤在印度、韓國批準了第一代Biosimilar產(chǎn)品。