熊秋芳，張小康，汪志紅，周國林，李世升

（武漢市蔬菜科學(xué)研究所，430345）

蘿卜（Raphanus sativusL.）為十字花科蘿卜屬一年或二年生雄雌同花的異花授粉作物，在我國栽培歷史悠久。蘿卜雜種優(yōu)勢十分明顯，目前主要利用雄性不育系進行制種。現(xiàn)代蘿卜育種所要改良的目標性狀也在不斷的變化，除了對豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病的要求越來越具體以外，又提出一些新的目標，如耐熱、耐抽薹、早熟、晚熟、品質(zhì)優(yōu)、口感佳。

常規(guī)育種方法在生產(chǎn)上應(yīng)用廣泛，技術(shù)容易掌握，具有不可低估的潛力，但也往往具有局限性，如育種年限長?，F(xiàn)代生物技術(shù)是細胞生物學(xué)與分子生物學(xué)理論指導(dǎo)下發(fā)展起來的一種高新技術(shù)，從20世紀70年代開始發(fā)展，給動植物品種改良帶來了一場革命。包括基因工程技術(shù)、小孢子培養(yǎng)技術(shù)、原生質(zhì)體融合技術(shù)、誘變技術(shù)在內(nèi)的現(xiàn)代生物技術(shù)大大加快了蔬菜遺傳改良的步伐，把育種技術(shù)從宏觀水平提高到微觀水平?，F(xiàn)對現(xiàn)代生物技術(shù)在我國蘿卜遺傳育種中的應(yīng)用加以綜述，并對蘿卜育種中還未涉及到的技術(shù)加以展望，以期為蘿卜遺傳育種及資源創(chuàng)新提供新的思路。

1 小孢子培養(yǎng)技術(shù)與蘿卜遺傳育種

1.1 小孢子培養(yǎng)技術(shù)

小孢子是指未成熟的單核花粉細胞。小孢子培養(yǎng)技術(shù)是將小孢子從花藥中分離出來，以單個小孢子作為外植體進行培養(yǎng)，促進其細胞分裂和單倍體胚，進而誘導(dǎo)發(fā)育成單倍體植株的過程。實踐證明，經(jīng)小孢子培養(yǎng)得到的雙單倍體或DH系株系間的性狀變異幅度大，超親現(xiàn)象和出現(xiàn)特殊優(yōu)良性狀的頻率顯著高于常規(guī)育種，株系內(nèi)性狀整齊，世代間穩(wěn)定性強。通過小孢子培養(yǎng)出來的自交系具有高度的純合性，以此配制的雜交組合往往具有更強的雜種優(yōu)勢。另外小孢子培養(yǎng)所得的胚狀體可以作為理想的轉(zhuǎn)基因受體，用于植物基因工程外源基因?qū)搿?/p>

1.2 蘿卜小孢子培養(yǎng)

蘿卜小孢子培養(yǎng)始于20世紀80年代，Liehter[1]首次報道了蘿卜游離小孢子培養(yǎng)成功誘導(dǎo)出胚狀體。Takahata等[2]對11份蘿卜材料進行了培養(yǎng)，其中有6份獲得了胚狀體，部分獲得了再生植株。張麗[3]以20個不同類型的蘿卜品種為材料，應(yīng)用大量元素減半的1/2 NLN液體培養(yǎng)基進行小孢子培養(yǎng)，其中1份材料獲了胚狀體。付傳翠等[4]認為蘿卜中普遍存在基因型偏性問題，在預(yù)處理過程中保存較高活力是小孢子誘導(dǎo)成功的關(guān)鍵。陳文輝等[5]對30份夏秋蘿卜進行培養(yǎng)，有4份秋蘿卜材料獲得胚狀體，認為基因型與誘導(dǎo)率有很大的相關(guān)性，低溫預(yù)處理花蕾可以顯著提高出胚率，33℃高溫?zé)峒ぬ幚?8 h是改變小孢子發(fā)育途徑的重要條件。周志國等[6]以蘿卜游離小孢子再生植株為試驗材料，采用形態(tài)學(xué)觀察、根尖染色體鑒定、流式細胞測定等方法進行了倍性檢測。結(jié)果表明，由游離小孢子培養(yǎng)獲得的植株中同時含有單倍體、雙單倍體和多倍體，來源不同的小孢子培養(yǎng)獲得的植株倍性比例不同，不同倍性植株具有不同的形態(tài)特征。熊秋芳[7]在1/2 NLN-12培養(yǎng)基中，游離小孢子培養(yǎng)20～25 d后，20個基因型中有8個獲得了胚狀體，占供試材料的40%。對千禧二號蘿卜雙單倍體植株進行親和指數(shù)的測定，結(jié)果顯示雙單倍體植株蕾期親和指數(shù)均大于5，花期親和指數(shù)均小于0.3，符合自交不親和系的標準，可以作為親本配制雜交組合。

2 原生質(zhì)體融合技術(shù)與蘿卜遺傳育種

2.1 原生質(zhì)體融合技術(shù)

原生質(zhì)體融合，亦稱細胞融合、體細胞雜交、超性雜交或超性融合，是指不同種類的原生質(zhì)體不經(jīng)過有性階段，在一定條件下融合創(chuàng)造雜種的過程。原生質(zhì)體融合可避免受精作用中的種的特異性配子識別反應(yīng)，有可能打破遠緣雜交中的有性不親和界限。原生質(zhì)體技術(shù)還可用于種質(zhì)資源的保存、細胞突變體的篩選、細胞器移植和外源DNA的導(dǎo)入等方面。自從1960年Cocking首次用纖維素酶制備番茄根原生質(zhì)體獲得成功后，迄今已有46個科160多個屬360多種植物的原生質(zhì)體再生植株問世，80多種科間、屬間、種間或品種間細胞融合獲得胞質(zhì)種。近年來，人們將原生質(zhì)體技術(shù)廣泛應(yīng)用于蔬菜育種工作中，并取得了令人矚目的成果，獲得了甘藍和白菜、番茄、油菜、蘿卜等體細胞雜交植株[8]。

2.2 蘿卜原生質(zhì)體融合

原生質(zhì)體融合是將兩種異源原生質(zhì)體，在誘導(dǎo)劑的誘發(fā)下相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合，再經(jīng)過細胞壁再生形成雜種細胞的過程。雷開榮等[9]以甘藍生產(chǎn)種為受體，以高抗黑腐病、軟腐病及根腫病的蘿卜野生材料為供體，在原生質(zhì)體融合前，用酶或酶+紫外線對供體原生質(zhì)體進行單因素或雙因素復(fù)合處理，以探討不同處理方法對植株再生的影響。結(jié)果表明，對供體親本進行雙因素復(fù)合處理，實現(xiàn)了原生質(zhì)體非對稱性融合并獲得再生植株。孫振久[10]先后探討了不同電融合條件、融合液、原生質(zhì)體密度及不同品種對甘藍和蘿卜原生質(zhì)體融合及細胞分裂的影響，為蘿卜原生質(zhì)體融合技術(shù)的應(yīng)用奠定了很好的基礎(chǔ)，是成功獲得雜種再生植株的前提。

遠緣雜交可以有效地進行異種、屬間遺傳物質(zhì)的相互引入和轉(zhuǎn)移，有目的地進行作物性狀改良，在作物育種上具有廣泛應(yīng)用。蘿卜具有優(yōu)良的抗線蟲病基因和細胞質(zhì)雄性不育基因，若通過遠緣雜交的方法將蘿卜的優(yōu)良基因?qū)肫渌魑镏校瑹o疑對當前作物育種具有重要的意義，同樣我們也可以將別的作物的優(yōu)良基因?qū)胩}卜中來。人們已獲得了蘿卜蕓薹、蘿卜甘藍、蘿卜黑芥等新品種[11]，但成功率不高。胡大有等[12]2004年利用3個甘藍型油菜品種和1個黑芥品種與日本櫻島大根蘿卜進行正反交，以研究遠緣雜交的親和性，試驗結(jié)果表明，蘿卜與油菜的遠緣雜交存在嚴重的生殖障礙。甘彩霞等[13]將蘿卜與大頭菜，張鳳銀等[14]將蘿卜與小白菜進行屬間雜交，其后代具體表現(xiàn)為莢果長到一定程度后黃化，雜種胚胎開始敗育。如果采用原生質(zhì)體融合技術(shù)則在一定程度上可克服雜交育種中諸如不親和性、性器官敗育障礙等問題。

3 誘變育種技術(shù)與蘿卜遺傳育種

3.1 誘變育種技術(shù)

誘變育種技術(shù)是人為利用物理或化學(xué)因素來處理種子、植株、組織、細胞或花粉，使其基因型產(chǎn)生遺傳變異，從中選擇培育新品種的方法。在眾多育種技術(shù)中，誘變育種因其突變頻率較高、突變譜較寬、能有效創(chuàng)造新類型種質(zhì)資源，且突變性狀穩(wěn)定較快，有利于加速新品種選育進程等優(yōu)勢，在作物育種中得到廣泛應(yīng)用，并且取得了極大成功；同時通過誘變技術(shù)獲得的一系列新穎突變種質(zhì)資源也是進行功能基因研究的重要基礎(chǔ)材料。

誘變育種技術(shù)包括輻射誘變、化學(xué)誘變和航天誘變3種。輻射誘變是指人為地利用物理誘變源，如離子束、γ射線、β射線、χ射線、中子等高能射線誘發(fā)作物產(chǎn)生突變，通過突變體的選擇和鑒定，直接或間接地育成可供生產(chǎn)利用的新品種?；瘜W(xué)誘變是用化學(xué)誘變劑如甲基磺酸乙酯（EMS）、硫酸二乙酯（DES）等烷化劑或堿基類似物等處理植物材料，通過與核苷酸中的磷酸、嘌呤、嘧啶等分子直接反應(yīng)來誘發(fā)突變，從而引起植株形態(tài)特征的變異。航天誘變又稱空間誘變，是將供試誘變材料搭乘返回式衛(wèi)星或宇宙飛船，送到距地球200～400 km的太空，利用空間宇宙射線的強輻射，在高真空、微重力和交變磁場等特殊環(huán)境中進行誘變處理，使供試材料產(chǎn)生有利變異，返回地面試種后繼續(xù)采用常規(guī)育種技術(shù)，從中選育出農(nóng)作物新品種。航天誘變可以使作物本身染色體產(chǎn)生缺失、重復(fù)、易位、倒置等基因突變。

3.2 蘿卜誘變育種

誘變實際上是一個“無中生有”的技術(shù)，它在創(chuàng)造或改變單基因控制的特殊性狀方面具有獨特的優(yōu)勢。蔬菜誘變育種始于20世紀50年代，70年代后期，隨著誘變育種技術(shù)與方法日趨成熟，育成的作物品種逐漸增多。近年來，我國科技工作者通過誘變技術(shù)已先后育成番茄、辣椒、甜瓜和黃瓜等蔬菜新品種。同屬十字花科的油菜誘變育種成績顯著，單采用60Co-γ射線處理干種子，先后育成了滬油 4號、111、73-103、秀油 1號，甘油 5號等新品種[15]。石淑穩(wěn)等[16]用EMS處理甘藍型油菜小孢子再生的胚性培養(yǎng)物，獲得長角果和矮稈突變體。甘藍型油菜皖油518接受空間誘變后，回收種子SP2代表現(xiàn)出豐富的遺傳變異，其中包括早熟、長角、多分枝、矮化、黃籽等突變類型。另外，SP2代各株系間產(chǎn)量亦表現(xiàn)出明顯差異，為培育高產(chǎn)油菜新品種創(chuàng)造了豐富的遺傳資源。蘿卜誘變育種在我國起步較晚，目前只有少量資源經(jīng)衛(wèi)星搭載，如蘇州地方蘿卜良種梅李60天經(jīng)神州一號搭載，返回地面后經(jīng)多代系統(tǒng)選育，具備了產(chǎn)量高、品質(zhì)好、生長速度快、抗病性強的特點。梁秋霞等[17]選取櫻桃蘿卜點點紅為材料，用低能Ar+注入其干種子后的生物學(xué)效應(yīng)進行了研究，結(jié)果表明不同劑量的低能Ar+注入都會使種子發(fā)芽率、成活率及不同階段的生長和發(fā)育產(chǎn)生變異。可以預(yù)見，蘿卜誘變育種具有廣闊的前景。

4 分子標記技術(shù)與蘿卜遺傳育種

4.1 分子標記技術(shù)

分子標記是以個體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反映。與其他幾種遺傳標記——形態(tài)學(xué)標記、生物化學(xué)標記、細胞學(xué)標記相比，DNA分子標記具有的優(yōu)越性有：大多數(shù)分子標記為共顯性，對隱性性狀的選擇十分便利；基因組變異極其豐富，分子標記的數(shù)量幾乎是無限的；在生物發(fā)育的不同階段，不同組織的DNA都可用于標記分析；分子標記揭示來自DNA的變異；表現(xiàn)為中性，不影響目標性狀的表達，與不良性狀無連鎖；檢測手段簡單、迅速。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，DNA分子標記技術(shù)已有數(shù)十種，廣泛應(yīng)用于遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親緣關(guān)系鑒別、基因庫構(gòu)建、基因克隆等方面。

4.2 分子標記技術(shù)在蘿卜中的應(yīng)用

據(jù) Vavilov 1923-1931年、Darling-ton 1945年和1955年的調(diào)查認為，蘿卜起源于中亞西亞和中國[18]，世界各地均有種植，歐美主要栽種小型四季蘿卜，亞洲以大型蘿卜為主。中國栽培蘿卜歷史悠久，蘿卜種質(zhì)資源十分豐富，我國現(xiàn)已收集保存的蘿卜資源有2 071份，研究這些資源的遺傳背景和關(guān)系是有效利用資源的前提[11]。

分子標記在蘿卜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析以及標記輔助選擇等方面得到應(yīng)用?？浊锷萚19]用RAPD標記對收集保存的來源于不同國家和地區(qū)的代表性栽培蘿卜種質(zhì)資源的遺傳多樣性進行探討性分析，認識其遺傳親緣關(guān)系，為大批量蘿卜種質(zhì)資源的鑒定和分類以及資源的有效利用提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。汪志偉等[20]以蘿卜恢復(fù)系和不育系配制雜交組合，并以174株個體組成的F2代分離群體作為恢復(fù)基因的標記群體。以分離群體的不育株和可育株分別建立不育池和恢復(fù)池，利用100個RAPD引物對兩池間的多態(tài)性進行研究。結(jié)果顯示，標記OPC6 1900與蘿卜細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因連鎖，可用于對育性恢復(fù)基因的標記輔助選擇。趙麗萍等[21]應(yīng)用SRAP與AFLP兩種分子標記技術(shù)進行了蘿卜品種鑒定分析。龔義勤等[22]、宋賢勇等[23]、武創(chuàng)等[24]對蘿卜基因組 DNA的 RAMPPCR分析體系進行優(yōu)化，并初步將體系應(yīng)用于蘿卜品種遺傳多樣性和種質(zhì)鑒定分析，為蘿卜種質(zhì)資源晚抽薹、CMS恢復(fù)基因、肉質(zhì)根形成等重要性狀標記與分子育種提供重要技術(shù)基礎(chǔ)。徐文玲等[25]采用AFLP結(jié)合銀染檢測技術(shù)，對與蘿卜耐抽薹基因連鎖的AFLP標記進行了篩選，結(jié)果以EcoRI-ACT/MseI-CTG和EcoRI-ACG/MseI-CAG兩對引物組合在抗感池中分別篩選出175 bp和123 bp的兩個標記CTG180和CAG120。譚婷婷等[26]利用蘿卜包含ORF138基因片段的Ogura胞質(zhì)雄性不育（CMS）分子標記對收集的5份蘿卜雄性不育系種子材料進行鑒定，結(jié)果表明有1份種質(zhì)為Ogura雄性不育材料，將Ogura分子標記應(yīng)用于蘿卜Ogura細胞質(zhì)雄性不育基因的轉(zhuǎn)育工作中，可以提高選擇效率，縮短育種年限。張庶等[27]利用cDNA-AFLP技術(shù)研究了蓮座期的福山包頭大白菜、翹頭青蘿卜及其雜種F1代的葉片，獲得特異表達的轉(zhuǎn)錄片段（TDF），從而為深入研究大白菜雜種優(yōu)勢相關(guān)基因和蘿卜-大白菜基因組互作奠定了基礎(chǔ)。

5 基因工程技術(shù)與蘿卜遺傳育種

5.1 基因工程技術(shù)

基因工程技術(shù)是將重組對象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的宿主細胞，構(gòu)建成基因工程菌（或細胞），實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進行復(fù)制和表達的技術(shù)。運用基因工程技術(shù)，可以改良植物品質(zhì)，進行植物抗蟲、抗病、抗寒、抗旱、抗除草劑的研究。

荊贊革等[28]根據(jù)GenBank中擴展蛋白序列設(shè)計特異引物，從蘿卜高代自交系NAU-LVYH06中克隆到一個擴展蛋白基因 RsEXPB1（GenBank accession No.GQ387363，GQ387364），該基因主要在蘿卜生育前期的幼葉、肉質(zhì)根木質(zhì)部和韌皮部中表達，且表達豐度可能與該部位細胞生長分裂狀態(tài)相關(guān)。潘大云等[29]報道了將蘿卜抗線蟲基因?qū)胗筒说难芯拷Y(jié)果。鄧曉東等[30]進行了蘿卜抗真菌蛋白基因Rs-AFPs轉(zhuǎn)化番茄的研究。李文君等[31]發(fā)表了蘿卜葉綠體ATP酶β亞基的cDNA克隆及序列特征的研究結(jié)果。王玲平等[32]以蘿卜品種圓白為材料，根據(jù)白菜CYP450基因CYP86MF保守序列設(shè)計引物，利用RT-PCR和5'/3'RACE相結(jié)合的方法克隆了一個CYP450基因的cDNA全長序列，并對它進行了序列分析，為CYP450基因的分離克隆及其在植物發(fā)育代謝中的功能研究提供一定的信息；丁云花等[33]開展蘿卜D染色體在7號連鎖群定位的研究，證實了定位有抗線蟲基因HsIRapls的7號連鎖群對應(yīng)于具線蟲抗性效應(yīng)的蘿卜D染色體；何啟偉等[34]采用RT-PCR的方法，先后從蘿卜花蕾中克隆了蘿卜花青素調(diào)控基因和開花關(guān)鍵基因LFY基因片段，并將后者構(gòu)建了dsRNA抑制雙元表達載體pPOK-A-I-S-L，轉(zhuǎn)入到蘿卜品種短葉13中，獲得了T0代種子。

6 結(jié)語

我國蘿卜種質(zhì)資源豐富，類型和品種繁多，且有多種食用方法。同時，蘿卜富含淀粉酶、硫代葡萄糖苷、VC、萊菔子素，以及其他維生素和多種礦物質(zhì)，有藥用價值和保健作用，是頗受歡迎的保健食品。目前，除東亞國家大面積種植蘿卜外，國際上其他國家則只有少量栽培，品種類型也少。因此，調(diào)整和把握好育種目標，改進和提高育種技術(shù)水平，育成各具特色，優(yōu)質(zhì)、抗病、穩(wěn)產(chǎn)、適應(yīng)性廣的品種，并繁育出優(yōu)質(zhì)種子，不僅能夠加快國內(nèi)品種更新，而且完全有條件推向國際市場。

可以預(yù)見，分子標記技術(shù)和原生質(zhì)體融合技術(shù)等現(xiàn)代生物技術(shù)在蘿卜育種中將有更大的應(yīng)用空間。傳統(tǒng)育種技術(shù)仍是重要的育種手段，現(xiàn)代生物技術(shù)與傳統(tǒng)育種技術(shù)相結(jié)合，必將大大加快蘿卜育種進程，創(chuàng)造出更多優(yōu)異的種質(zhì)資源，培育出更多優(yōu)良性狀的蘿卜新品種。例如，采用小孢子培養(yǎng)技術(shù)，加快育種材料的純合過程，并配合強化室內(nèi)和田間主要經(jīng)濟性狀的鑒定、選擇，縮短優(yōu)良親本系選育年限。對耐抽薹性、耐寒性、耐熱性等主要經(jīng)濟性狀進行分子標記研究，輔助常規(guī)親本系及雜種一代的鑒定與選擇，提高選擇的效率和準確性。運用基因工程，轉(zhuǎn)化特異基因，創(chuàng)新蘿卜種質(zhì)，利用原生質(zhì)體融合技術(shù)、誘變技術(shù)豐富育種材料。

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