莊金秋，梅建國，沈志強

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；2.吉林大學畜牧獸醫(yī)學院，吉林長春 130062）

博卡病毒（Bocavirus）為細小病毒科細小病毒亞科博卡病毒屬成員，博卡病毒屬包括牛博卡病毒、人博卡病毒（1型～4型）、犬博卡病毒（1型）和豬博卡病毒4種［1］。人博卡病毒最早于2005年在一名表現(xiàn)下呼吸道疾病的瑞典兒童體內(nèi)經(jīng)PCR技術被首先鑒定，其基因組大小為5.2kb左右，為無囊膜單股線狀DNA病毒［2］。目前，已有許多國家報道人博卡病毒病的流行［3］。豬博卡病毒（Porcine Bocavirus，PBoV）則于2009年首次由瑞典科研人員從表現(xiàn)斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）的瑞典發(fā)病豬群中被檢出并鑒定［4］。目前，豬博卡病毒作為新發(fā)現(xiàn)的病原，已成為世界各國科研人員研究的熱點。研究表明，豬博卡病毒除了與細小病毒科其他成員同有2個開放閱讀框架（ORF1和ORF2）外，還在非結構蛋白和結構蛋白編碼區(qū)之間有第3個開放閱讀框架（ORF3），編碼1個高度磷酸化的功能尚未弄清的非結構性蛋白質。ORF1編碼1個與病毒基因復制有關的非結構蛋白質，ORF2編碼2個衣殼蛋白（VP1和VP2）。根據(jù)ORF2編碼的VP1病毒蛋白的不同，已報道的6個豬博卡病毒可分為4個型（PBoV1～PBoV4）［5－6］。

1 博卡病毒的發(fā)現(xiàn)

2009年，瑞典科研人員運用隨機多重置換擴增方法（random multiple displacement amplification，MDA）（病毒宏基因組研究方法之一）和高通量測序技術在患PMWS的豬淋巴結中擴增出了一段長1 879bp的核苷酸序列，將該段序列與已知病毒序列比較，發(fā)現(xiàn)其完整的NP1基因及部分VP1／VP2基因與人類博卡病毒相近，故將該病毒歸類為細小病毒科、細小病毒亞科、博卡病毒屬［7－8］。

2 博卡病毒與疾病的相關性

目前，在歐洲一些國家和我國均已報道了PBoV在豬群中的流行狀況，顯示在健康豬群和表現(xiàn)呼吸道癥狀的豬群中均檢出較高的陽性率，可見其流行面很廣。由于對PBoV的研究才剛剛起步，對其全基因組大小、體外培養(yǎng)細胞系、物理化學性質、傳播途徑等方面都不甚明了，因而其單獨的致病性不得而知。但PBoV在病豬體內(nèi)被檢出，暗示其對豬有一定的致病性。多數(shù)（PBoV1、PBoV2及PBoV4）分離自患PMWS的病豬，并且在病豬的檢出率高于健康豬。這表明PBoV與PMWS的發(fā)生有一定相關性，其也可能與豬圓環(huán)病毒2型（PCV－2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）和豬瘟病毒（CSFV）等病原混合感染導致豬發(fā)生更嚴重的疾?。?－10］。自2006年，我國暴發(fā)豬高熱病以來，其主要病原被確定為PRRSV，但在PRRSV陽性的病料中也頻繁地檢出PCV－2、豬偽狂犬病病毒（PRV）及CSFV等，而在這些病料中PBoV也被檢出，而且陽性率大于70%以上，并且病豬表現(xiàn)明顯的呼吸癥狀及肺組織損傷。這表明PBoV可能在豬高熱病中也扮演一定的角色，其致病機理有待于進一步研究［11］。2010年至今中國部分地區(qū)規(guī)模豬場暴發(fā)流行的仔豬嚴重腹瀉，哺乳仔豬多在出生2d～3d后出現(xiàn)劇烈的腹瀉，呈黃綠色、淡綠色或灰白色水樣糞便，部分仔豬有嘔吐癥狀，迅速脫水消瘦，病豬精神沉郁、被毛粗亂，少吃或不吃、脫水消瘦，一般于5d～7d內(nèi)死亡，10日齡以內(nèi)的仔豬死亡率高達50%～80%，隨日齡的增加死亡率降低。病死豬尸體消瘦、脫水、胃黏膜充血，有時有出血點，小腸黏膜充血，腸壁變薄無彈性，內(nèi)含水樣稀便，腸系膜淋巴結腫脹。同一豬場內(nèi)母豬和育肥豬無明顯癥狀。按照流行性腹瀉、傳染性胃腸炎和輪狀病毒處理，基本無明顯效果。有些豬場調(diào)整免疫程序，做了豬瘟或者偽狂犬病乳前免疫接種，效果很差。一些學者也推測可能與PBoV感染存在關聯(lián)。雖然尚未弄清PBoV感染的臨床意義和流行病學特征，但值得關注和持續(xù)性監(jiān)測。

3博卡病毒的培養(yǎng)與檢測

3.1博卡病毒的培養(yǎng)

目前，只有北愛爾蘭科研人員McKillen J等［12］對豬博卡病毒的細胞適應性進行了研究，其可以在豬原代腎細胞上生長且經(jīng)過培養(yǎng)4代后，導致細胞出現(xiàn)明顯的細胞病變。他們在北愛爾蘭豬糞便樣品的細胞培養(yǎng)物中分離到2株豬博卡病毒，經(jīng)基因分型分析確認為PBoV3和PBoV4型。此外，該研究還對細胞培養(yǎng)液進行收集、梯度離心處理，電鏡觀察，結果發(fā)現(xiàn)分離的病毒直徑大小為25nm～30 nm，與其他細小病毒亞科成員的病毒粒子大小相似。

3.2博卡病毒的檢測

3.2.1聚合酶鏈反應 聚合酶鏈反應（PCR）檢測方法是分子水平上常用的方法之一，具有很好的敏感性、重復性和特異性，已廣泛應用于動物疫病的檢測。瑞典學者Blomstrom A L等［4］（采用PCR技術對34頭患PMWS的病豬和24頭健康豬進行了PCV－2、豬輸血傳播病毒（PTTV）和PBoV的檢測，結果PMWS病豬中PBoV陽性率為88%，而健康豬群陽性率為46%，說明PBoV可能在PMWS致病作用中參與了共感染。Cadar D等［13］（于2006年－2007年和2010年－2011年狩獵季節(jié)在羅馬尼亞西部地區(qū)采集了842頭份野豬樣品，經(jīng)PCR檢測，共檢出PBoV陽性樣品109份，陽性率為12.94%，其中2006年－2007年狩獵的野豬樣品的陽性率為9.14%（43／470），而2010年－2011年狩獵的野豬樣品的陽性率為17.74%（66／372），顯示出攀升趨勢。不同年齡段野豬陽性率存在差異，其中6月齡～12月齡的野豬陽性率為77.06%（84／109），12月齡～36月齡的野豬陽性率為22.94%（25／109），說明PBoV感染主要發(fā)生在低年齡段豬群。經(jīng)基因測序，表明野豬和家豬的PBoV基因同源性很高。國內(nèi)翟少倫等［11］建立了PBoV1的PCR診斷方法，并對2009年來自江西、浙江等9個省市送檢的191份疑似豬高熱病病料（組織樣品108份，血清76份和精液7份）進行檢測，結果檢出PBoV陽性樣品75份，陽性率為39.3%（75／191），表明我國豬群中豬博卡病毒相當流行。他們建立的PCR方法敏感性、重復性和特異性均較好，敏感性達32.2ng／μL。Zhai S L等［6］對中國豬群中PBoV的感染情況進行了調(diào)查。經(jīng)PCR檢測，發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)呼吸道病癥的斷奶豬PBoV陽性率達69.7%（69／99），其他豬群陽性率為0～13.6%，暗示PBoV可能在豬呼吸道疾患中扮演一定的角色。對部分VP1／2基因序列進行分析，發(fā)現(xiàn)與參考毒株同源性達99%～100%，僅在5個核苷酸位點發(fā)生突變。Zhang H B等［14］于2010年收集了中國10個省份的166份樣品進行豬博卡病毒分型檢測，結果PBoV1～PBoV4型的檢測率分別為28.9%、6.6%、19.3%和39.7%，說明中國豬群中PBoV感染狀況非常復雜。Lau S K等［15］從中國香港生豬屠宰場和養(yǎng)豬場的健康豬和病死豬中采集了淋巴結、血清和糞便等樣品共333份，采用PCR技術檢出PBoV陽性樣品55份，總陽性率為16.5%。經(jīng)對病毒全基因組序列的測定，表明存在2個型別的PBoV，即PBoV3和PBoV4，推測可能在豬體內(nèi)不同PBoV毒株間發(fā)生了變異和重組。李彬等［16］建立了檢測PBoV的PCR檢測方法。陽性樣品可出現(xiàn)約為270bp的片段。他們建立的檢測方法敏感性高、特異性好、操作簡便、迅速，并且對檢測材料質量要求低，便于臨床應用?？傊?，已經(jīng)建立了越來越多的PBoV的PCR檢測方法并被應用于臨床樣品的檢測。

3.2.2 實時定量聚合酶鏈反應 實時定量聚合酶鏈反應（Real－time PCR）是在PCR的基礎上建立起來的診斷方法，由于省去了普通PCR需要凝膠成像的步驟，可以大大縮短疫病的檢測時間。Li B等［17］建立了檢測PBoV的Real－time PCR方法，經(jīng)對258份豬樣品的檢測，檢出陽性樣品114份，總陽性率為44.2%（114／258）。發(fā)病豬群的PBoV 陽性率明顯要高，達56.1%（101／180），而健康豬群的陽性率則為16.7%（13／78）。他們建立的real－time PCR 方法，敏感性、重復性和特異性均較好，敏感性達20個質?？截悺｜S律等［18］立的PBoV2 Taq Man熒光定量PCR方法，結果表明PBoV2最低核酸檢出量為67.3拷貝／μL。

3.2.3 間接免疫熒光法 McKillen J等［12］建立了PBoV的原代細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，同時為了鑒定病毒在細胞上的生長情況，還建立了間接免疫熒光方法，結果發(fā)現(xiàn)綠色熒光集中在豬原代腎細胞的細胞核。

3.2.4 環(huán)介導等溫擴增（LAMP）技術 李彬等［19］建立了一種豬博卡病毒的LAMP檢測方法并組裝了檢測試劑盒，該試劑盒包含4條引物，檢測時首先按照常規(guī)方法提取待檢樣品的核酸，然后利用LAMP檢測試劑盒檢測樣品核酸，從而判斷樣品中是否含有豬博卡病毒。他們研制的試劑盒使用簡單，結果直觀，特異性及敏感性高。

此外，李彬等［20］報道對PBoV1的NP1基因進行原核表達，研究結果表明NP1蛋白可作為診斷抗原的候選蛋白，這也為PBoV1的血清學診斷積累了材料。

4 結語

PBoV作為豬群中的一種新發(fā)現(xiàn)病原，自2009年以來，人類對它的研究正逐步深入。盡管在其病原學、流行病學、診斷方法等方面取得了很大的突破，但在其基因型分型、致病性、感染性克隆、穩(wěn)定的體外培養(yǎng)系統(tǒng)、鑒別診斷方法等方面的研究還比較薄弱。雖然表明本病毒可能是豬呼吸道疾患的致病因子之一，并且與臨床豬病發(fā)生具有潛在關聯(lián)，常與PCV－2、PTTV和PRRSV等發(fā)生混合感染，但其致病機理以及在PMWS中扮演的角色需要進一步的研究。同時在健康豬群相關樣品中也能檢測到較高的博卡病毒陽性率，說明豬博卡病毒感染的廣泛存在。因此，只有對其臨床表現(xiàn)、致病機理、傳播機制和基因遺傳演化等方面進行更深入的研究，才能有助于對PBoV的真正認識和有效防控。相信通過科研人員今后更多的研究，我們會得到更多PBoV的相關知識。

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