邵軍麗，吳 豐

1.廣東醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東東莞 523808;2.東莞中學(xué)松山湖學(xué)校生物科組

專題·幽門螺桿菌

幽門螺桿菌檢測(cè)方法研究新進(jìn)展

邵軍麗1，吳 豐2

1.廣東醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東東莞 523808;2.東莞中學(xué)松山湖學(xué)校生物科組

本文就近年來幽門螺桿菌檢測(cè)方法新進(jìn)展作一簡(jiǎn)要的概述，主要從細(xì)菌培養(yǎng)、快速尿素酶實(shí)驗(yàn)、組織學(xué)檢查、尿素呼氣實(shí)驗(yàn)、抗體檢測(cè)、糞便抗原檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)等幾個(gè)方面展開。

幽門螺桿菌;檢測(cè)方法;快速尿素酶實(shí)驗(yàn);尿素呼氣實(shí)驗(yàn)

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)感染與慢性胃炎、胃潰瘍、胃腺癌、胃黏膜相關(guān)性淋巴瘤有著密切的聯(lián)系，在胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍和胃癌患者中H.pylori感染率約90%。世界衛(wèi)生組織已把H.pylori列為第一類致癌因子，并明確為胃癌的危險(xiǎn)因子。所以H.pylori感染的早診斷、早治療十分重要和必要。H.pylori檢測(cè)是H.pylori感染診斷的重要手段，本文就H.pylori檢測(cè)方法近年來的發(fā)展作一概述。

1 細(xì)菌培養(yǎng)

一般用腦心浸液(或哥倫比亞瓊脂或布氏瓊脂)添加一定量的血清或全血，選擇性抗生素做培養(yǎng)基，微氧條件培養(yǎng)3～5 d，根據(jù)菌落特征、涂片鏡檢、三酶(尿素酶、氧化酶、過氧化氫酶)試驗(yàn)判定為H.pylori陽性或陰性。

H.pylori在37℃保存需要每隔4～7 d傳代才能保持其活力，而凍存的H.pylori復(fù)蘇又有成功率低、時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)。Xu等［1］發(fā)現(xiàn)在布氏或腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基上將H.pylori深度穿刺，在37℃ 10%CO2條件下培養(yǎng)，無需傳代即可以保持活力56 d。

2 快速尿素酶試驗(yàn)

快速尿素酶試驗(yàn)(rapid urease test，RUT)原理是H.pylori富含的高活性尿素酶可分解尿素產(chǎn)生氨，使pH升高，指示劑顏色發(fā)生改變。盡管尿素酶并不只是H.pylori所特有，但胃內(nèi)存在尿素酶是H.pylori存在的證據(jù)之一。

一般在胃鏡檢查時(shí)，鉗取近幽門處的胃竇黏膜活檢標(biāo)本置于RUT試劑中，5 min內(nèi)即可通過顏色變化判定結(jié)果。傳統(tǒng)的RUT試劑由2%尿素和酚紅組成。Mclntosh等［2］優(yōu)化了尿素的濃度和指示劑的種類，發(fā)現(xiàn)5%尿素和溴甲酚紫可以改善豬胃黏膜尿素酶活性的可視性。Hsu等［3］發(fā)現(xiàn)使用來自胃竇和胃體的雙樣本可以提高尿素酶檢測(cè)的靈敏度。

3 組織學(xué)檢查

一般將通過內(nèi)鏡鉗取的活檢標(biāo)本立即用10%甲醛固定，然后進(jìn)行常規(guī)包埋、切片、染色、水洗等操作，最后鏡檢。鏡檢下H.pylori可呈稍彎曲狀、S狀、短弧狀、桿狀、海鷗狀。常用的染色方法有改良Warthin-Starry 銀鹽、改良 Giemsa、HE、Gimenez、石炭酸復(fù)紅、免疫組化等。改良Warthin-Starry銀鹽染色法的敏感度100%、特異度95.6%，明顯高于RUT和14C-尿素呼氣試驗(yàn)(14C-urea breath test，14C-UBT)2 種方法［4］。劉莉等［5］比較了 HE、改良 Giemsa、免疫組化3種染色方法，結(jié)果是陽性率無顯著性差異，但免疫組化時(shí)H.pylori菌體與周圍組織對(duì)比度最強(qiáng)，最易識(shí)別。

放大內(nèi)鏡結(jié)合窄帶成像技術(shù)(narrow-band imaging，NBI)能夠精確觀察消化道黏膜上皮形態(tài)，可以在內(nèi)鏡下即時(shí)觀察預(yù)測(cè)H.pylori的感染，還可以預(yù)測(cè)胃炎的組織學(xué)嚴(yán)重程度和胃萎縮情況［6］。共聚焦激光顯微內(nèi)鏡(confocal laser endomicroscopy，CLE)不僅能觀察黏膜表面上皮形態(tài)，還可以觀察到黏膜下組織形態(tài)，與NBI技術(shù)相比功能相同但診斷更精確。Ji等［7］利用CLE進(jìn)行診斷，將胃黏膜表面具有白點(diǎn)、中性粒細(xì)胞和微小膿腫3種特征之一者診斷為H.pylori感染，診斷結(jié)果與常規(guī)組織學(xué)檢查結(jié)果有很好的相關(guān)性，其準(zhǔn)確度、靈敏度和特異度分別為 92.8%、89.2%、95.7%。

4 尿素呼氣試驗(yàn)

哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不存在尿素酶，而且H.pylori是胃內(nèi)具有高活性尿素酶的細(xì)菌，所以可以通過UBT測(cè)定尿素酶的活性間接檢測(cè)H.pylori。檢測(cè)前受檢者口服同位素13C或14C標(biāo)記的尿素膠囊，胃內(nèi)H.pylori產(chǎn)生的尿素酶催化尿素迅速水解成NH4+和H13或H14，后者吸收入血液經(jīng)肺以13CO2或14CO2形式呼出，收集呼氣標(biāo)本并測(cè)量13CO2或14CO2，根據(jù)絕對(duì)值或超基準(zhǔn)值大小便可判斷有無H.pylori的感染。

大多數(shù)的研究表明，13C-UBT的敏感性和特異性高于IgG和糞便抗原檢測(cè)［8］。13C-UBT與RUT比較，敏感性的高低不一致，特異性上13C-UBT稍高［8］。

13C-UBT對(duì)于成人來講是一個(gè)可靠的診斷方法，但對(duì)于兒童其準(zhǔn)確性隨年齡段不同而有變化。Leal等［9］將13C-UBT用于兒童的研究進(jìn)行了系統(tǒng)回顧和Meta分析，結(jié)果表明，13C-UBT應(yīng)用于＞6歲的兒童準(zhǔn)確性較高、較穩(wěn)定［(敏感度96.6%，特異度97.7%，陽性似然比(positive likelihood ratio，LR+)42.6，陰性似然比(negative likelihood ratio，LR－)0.04，診斷比值比(diagnostic odds ratio，DOR)1042.7］;13C-UBT 應(yīng)用于≤6歲的兒童中準(zhǔn)確性有些變動(dòng)并且低幾個(gè)百分點(diǎn)，尤其是特異度(敏感度95%，特異度93.5%，LR+11.7，LR－0.12，DOR 224.8)，但是準(zhǔn)確性可以通過調(diào)整截?cái)嘀怠z測(cè)前進(jìn)餐時(shí)間和尿素劑量來改善［9］。

Petrovic等［10］的實(shí)驗(yàn)表明，以80%超基準(zhǔn)值為標(biāo)準(zhǔn)，與組織學(xué)檢查法相比，14C-UBT敏感度94.5%、特異度100%、陽性預(yù)測(cè)值100%、陰性預(yù)測(cè)值96.3%、準(zhǔn)確度97.8%。14CO2測(cè)試用的液體閃爍計(jì)數(shù)儀要比13CO2測(cè)試用的同位素質(zhì)譜儀成本低，所以14C-UBT作為非侵入性的檢測(cè)方法經(jīng)常被用來測(cè)定兒童H.pylori的感染狀況。如李紅艷等［11］采用14C-UBT對(duì)武漢市3 368例兒童進(jìn)行了H.pylori感染的臨床分析。

由于14C-UBT有輻射，所以患者經(jīng)常會(huì)有心理負(fù)擔(dān)。實(shí)際上，受檢者檢測(cè)1次所攝入37 kBq(1 muCi)的14C-尿素，不及受檢者1 d的自然本底照射劑量，而且?guī)缀跛袛z入的輻射量在72～120 h內(nèi)都以尿和呼氣的形式排出體外，所以14C-UBT是安全的，無需擔(dān)心［12］。

5 抗體檢測(cè)

H.pylori進(jìn)入人體后會(huì)產(chǎn)生特異性抗體，通過對(duì)特異性抗體的檢測(cè)可以間接證明病原菌的存在。目前已有很多成熟、便捷、效果較好的商品化H.pylori血清抗體檢測(cè)試劑或試劑盒，所用技術(shù)有酶聯(lián)免疫、化學(xué)發(fā)光酶免疫、膠體金免疫、免疫印跡等，所用抗原有重組蛋白、化學(xué)合成多肽等，步驟有一步的、多步的，功能有定性的、定量的，檢測(cè)的抗體有H.pylori-IgG、尿素酶抗體、CagA抗體、VacA抗體、鞭毛蛋白抗體、熱激蛋白抗體、外膜蛋白-67抗體等。如我國某公司2009年被批準(zhǔn)生產(chǎn)的H.pylori尿素酶抗體檢測(cè)試劑盒，采用雙抗原夾心法免疫測(cè)定原理，結(jié)合膠體金免疫層析法即時(shí)檢驗(yàn)技術(shù)，一步操作、肉眼觀察、10～20 min出結(jié)果，是一種適合人群H.pylori感染篩查的快速體外診斷試劑盒，在國內(nèi)得到了廣泛的應(yīng)用，如蔣斌［13］使用該試劑盒對(duì)2 998例健康體檢人群進(jìn)行血清H.pylori尿素酶抗體進(jìn)行檢測(cè)。

也有一些實(shí)驗(yàn)室在嘗試建立新型抗體檢測(cè)方法，如Stege等［14］利用磁性納米珠作為H.pylori免疫親和配體的固化載體、毛細(xì)管電泳分離、激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器檢測(cè)，建立了35 min內(nèi)即可完成的全自動(dòng)在線定量檢測(cè)H.pylori抗體的方法。

抗體檢測(cè)的樣本大多是血清或全血，但也有對(duì)其他樣本檢測(cè)的報(bào)道。Sonmezoglu等［15］用 ELISA來檢測(cè)唾液的H.pylori-IgG，敏感度、特異度分別為87%、73%。Nguyen等［16］用試劑盒 RAPIRUN來檢測(cè)尿液的H.pylori抗體，敏感度、特異度和準(zhǔn)確度分別為79.5%、90.7%、84.5%。

6 糞便抗原檢測(cè)

糞便抗原檢測(cè)是一個(gè)方便、快捷、非侵入性、不需要特殊儀器，最重要的是取材方便的一種方法，尤其適用于小孩，近年來也獲得廣泛應(yīng)用，如 Pourakbari等［17］用重組蛋白制備的兔抗烷基過氧化物還原酶(alkyl hydroperoxide reductase protein，AhpC)的多克隆抗體來檢測(cè)糞便中AhpC蛋白。

Leal等［18］對(duì)基于小孩糞便 H.pylori診斷的文獻(xiàn)做了系統(tǒng)回顧、Meta分析，結(jié)果表明單克隆抗體ELISA表現(xiàn)最好，敏感度97%、特異度97%、LR+29.9、LR－0.03;多克隆抗體ELISA次之，敏感度92%、特異度93%、LR+16.2、LR－0.09;單克隆抗體一步法檢測(cè)再次之，敏感度88%、特異度98%、LR+17.1、LR－0.18。

7 分子生物學(xué)方法

7.1 核酸雜交 核酸雜交是用32P、或生物素、或熒光物質(zhì)等標(biāo)記H.pylori特異性的核酸探針，經(jīng)過與生物樣本原位雜交或與吸附樣本DNA的膜雜交等程序來檢測(cè)H.pylori。該技術(shù)是PCR技術(shù)廣泛使用之前用的較多的一種分子生物學(xué)診斷方法，具有敏感性高和特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，但操作繁瑣。近年來的一個(gè)發(fā)展是用肽核酸來代替DNA作為基因的探針，因?yàn)殡暮怂岵粌H具有核酸探針的功能，而且具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、不被核酸酶和蛋白酶降解的特點(diǎn)。如Cerqueira等［19］用肽核酸-熒光原位雜交來檢測(cè)懸浮培養(yǎng)的H.pylori的克拉霉素抗性，敏感度和特異度均為100%。

7.2 PCR方法 PCR方法測(cè)定 H.pylori的 DNA，具有簡(jiǎn)便、快捷、靈敏度高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，不需要完整的細(xì)菌活體存在，所以它不僅可以檢測(cè)胃的活檢標(biāo)本，也可以測(cè)定胃液、糞便、牙菌斑、水等其他離體標(biāo)本，而且樣品不需要嚴(yán)格的保存條件。所以PCR方法既適用于臨床檢測(cè)，又是流行病學(xué)調(diào)查的重要工具。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)(RAPD)是一項(xiàng)較早應(yīng)用的PCR檢測(cè)技術(shù)，利用非細(xì)菌特異性的隨機(jī)短鏈引物擴(kuò)增，產(chǎn)生高度特異的片段，根據(jù)這些片段的組成來檢測(cè)H.pylori。但這個(gè)方法首先要求培養(yǎng)分離出單一的菌株，增加了使用上的難度，所以以特定基因?yàn)槟繕?biāo)的PCR技術(shù)更為常用，如普通PCR、Nested-PCR、Realtime PCR、PCR-RFLP等，作為擴(kuò)增目標(biāo)的特定基因有H.pylori的 RNA 基因(如 16S rRNA、5S rRNA、23S rRNA基因等)、尿素酶基因(如 ureA、ureB、ureC基因等)、VacA 基因、CagA 基因等。如 Kargar等［20］以 16S rRNA基因?yàn)槟繕?biāo)的PCR來檢測(cè)H.pylori的感染，以23S rRNA基因?yàn)槟繕?biāo)的Real-time PCR來檢測(cè)H.pylori的數(shù)量和克拉霉素抗性。CagA基因是一個(gè)重要的毒力因子，CagA陽性的菌株有更大的毒力，以該基因?yàn)槟繕?biāo)的PCR可以對(duì)菌株毒力分型，如Saribas等［21］用PCR方法鑒定198個(gè)臨床積累的H.pylori菌株，58.6%為CagA基因陽性。

Rasmussen等［22］通過胃活檢、唾液和牙菌斑樣本PCR和Southern blot實(shí)驗(yàn)表明，胃活檢樣本和口腔樣本的H.pylori陽性存在正相關(guān)關(guān)系。牙菌斑中會(huì)有很多親緣關(guān)系密切的細(xì)菌，所以目標(biāo)基因和引物數(shù)量的選擇對(duì)結(jié)果會(huì)有重大影響，如果檢測(cè)時(shí)選擇兩個(gè)目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增就更為可靠［23］。

胃上皮細(xì)胞大約1～3 d會(huì)更新1次，脫落的上皮細(xì)胞會(huì)攜帶H.pylori-DNA隨糞便排出，所以可以用PCR方法來檢測(cè)。但是糞便含有Taq聚合酶的抑制劑-復(fù)合多糖［24］，難以從糞便中提取的DNA中徹底去除，使得相應(yīng)的PCR檢測(cè)的靈敏度仍不高［18］。Horemans等［25］最近提出了一種從糞便中提取DNA的新方法，可以有效減少樣品DNA中混雜的復(fù)合多糖，即先用生物素標(biāo)記的探針與糞便樣本中的目標(biāo)DNA雜交，然后用鏈霉親和素包被的磁珠分離DNA，洗滌3次后可以直接用于普通或定量PCR檢測(cè);以感染H.pylori的沙鼠糞便為樣本的實(shí)驗(yàn)表明，該提取DNA的方法與作為對(duì)照的商業(yè)化的DNA提取試劑盒相比靈敏度提高了10倍。

8 其他新方法

Ulanowska等［26］用固相微萃取-氣質(zhì)(SPME-GC/MS)分析發(fā)現(xiàn)，在H.pylori感染組所呼出的揮發(fā)性有機(jī)混合物(volatile organic compounds，VOCs)和懸浮培養(yǎng)的H.pylori所釋放的混合氣體中可以測(cè)到異丁烷、2-丁酮和乙酸乙酯等有機(jī)物，但在健康自愿者組所呼出的VOCs中檢測(cè)不到，該方法可能發(fā)展為一個(gè)非常有用的非侵入性的檢測(cè)方法。伏安生物傳感器也被用在了 H.pylori的檢測(cè)上［27］。

9 結(jié)語

綜上，H.pylori的檢測(cè)方法有很多，但各有優(yōu)缺點(diǎn)。一般來說，培養(yǎng)最為可靠，應(yīng)看作是H.pylori診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是敏感性差，需要一定的設(shè)備，技術(shù)要求高、費(fèi)時(shí)長(zhǎng)、不能及時(shí)報(bào)告，一般不作為常規(guī)診斷方法;組織學(xué)檢查也具有較高的診斷價(jià)值，但受H.pylori的灶性分布、取材、制片質(zhì)量限制，容易出現(xiàn)假陰性，不適用于常規(guī)診斷;RUT實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便、快捷、價(jià)格低廉，因而在臨床上是侵入性檢測(cè)中的首選方法，但非H.pylori尿素酶細(xì)菌可能造成假陽性［28］，H.pylori灶性分布及取材的限制可能造成假陰性;13/14C-UBT不需通過胃鏡取材，不受胃內(nèi)H.pylori灶性分布的限制，是追蹤H.pylori治療效果的可靠標(biāo)準(zhǔn)，但非H.pylori尿素酶細(xì)菌可能造成假陽性，并且13C尿素呼氣試驗(yàn)所需質(zhì)譜儀較昂貴，難于普及，而14C由于其放射性，不易被兒童和孕婦接受;血清學(xué)檢測(cè)H.pylori抗體，不需通過內(nèi)鏡取材，具有簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、無需專用儀器和設(shè)備、成本低等優(yōu)點(diǎn)，適用于大批量的流行病學(xué)調(diào)查，但不宜作為療效判斷指標(biāo)，因?yàn)镠.pylori根除后抗體水平3個(gè)月才開始下降，6～12個(gè)月尚難消失;糞便抗原檢測(cè)也是一種較好的非侵入性檢測(cè)H.pylori的方法，并且不需要特殊儀器、操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、價(jià)廉、標(biāo)本易于收集，在根除治療4～6 d后H.pylori從糞便中消失，所以可作為抗H.pylori治療后療效觀察的又一指標(biāo)，但目前還未廣泛應(yīng)用;PCR技術(shù)敏感性高、特異性好，適用于研究和臨床療效判別，但需要專門的儀器。具體選用哪種方法就需要結(jié)合方法的特點(diǎn)、現(xiàn)有條件和檢測(cè)目的等因素來選擇。

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Development of detectionMethodsfor Helicobacter pylori

SHAO Junli1，WU Feng2
1.School of Public Health，Guangdong Medical College，Dongguan 523808;2.Biology Group，Dongguan Middle School-SSL School，China

In this artical we are mainly from several aspects included culture，rapid urease test，histology examination，urea breath test，antibody detection，stool antigen test and molecular biological detection.The development of detectionMethodsfor Helicobacter pylori was reviewed briefly in recent years.

Helicobacter pylori;DetectionMethods;Rapid urease test;Urea breath test

R573

A

1006－5709(2012)08－0691－04

2012-03-25

10.3969/j.issn.1006-5709.2012.08.002

廣東醫(yī)學(xué)院博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目(XB1012)

邵軍麗，博士，講師。E-mail:shaojunli421@yahoo.com.cn