黃翔峰，朱 菡，陸麗君，彭開銘，詹鵬舉，劉 佳

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一株生物表面活性劑產(chǎn)生菌的優(yōu)選及其產(chǎn)物性質(zhì)研究

黃翔峰，朱 菡，*陸麗君，彭開銘，詹鵬舉，劉 佳

（同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，污染控制與資源化研究國家重點實驗室，上海，200092）

從實驗室保藏的22株生物表面活性劑產(chǎn)生菌中優(yōu)選出一株具有顯著表面活性的枯草芽孢桿菌CICC 23659，研究4種培養(yǎng)基對該菌株產(chǎn)生的生物表面活性劑產(chǎn)量及性質(zhì)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMSM培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的產(chǎn)物表面活性最高。2 g/L的粗產(chǎn)物具有顯著的排油活性，對中長鏈烷烴和苯環(huán)類疏水性物質(zhì)具有較好的乳化效果，且能形成穩(wěn)定的乳狀液。純化產(chǎn)物的CMC為31.5 mg/L，最低表面張力為27.8 mN/m。產(chǎn)物經(jīng)TLC、紅外光譜及高效液相色譜鑒定為surfactin。

枯草芽孢桿菌；生物表面活性劑；乳化能力；表面活性；鑒定

微生物在一定條件下培養(yǎng)時，其代謝過程會分泌一些具有表界面活性，集親水基和疏水基結(jié)構(gòu)于一分子的兩親化合物，即生物表面活性劑。據(jù)報道，生物表面活性劑主要有糖脂、脂肽和脂蛋白、脂肪酸和磷脂、聚合物和全胞表面本身等五大類[1]。其中脂肽類表面活性劑具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和生理功能，能促進(jìn)細(xì)菌聚集、促進(jìn)疏水性物質(zhì)的溶解，以提高細(xì)胞的同化作用等[2]，并對溫度、酸堿、鹽離子等化學(xué)物質(zhì)具有穩(wěn)定性。因其無毒、高效、易降解的優(yōu)點，目前已逐漸應(yīng)用于石油回收、溢油控制、土壤修復(fù)[3]、農(nóng)作物病害防治[4]等領(lǐng)域，引起研究者的廣泛重視。

本研究從多株生物表面活性劑產(chǎn)生菌中優(yōu)選出一株枯草芽孢桿菌，并確定合適的培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)生物表面活性劑，考察該產(chǎn)物對各類疏水性物質(zhì)的乳化能力，并采用TLC、紅外光譜、高效液相色譜技術(shù)鑒定該生物表面活性劑類型。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養(yǎng)基

CICC 23659、CICC 10275、CICC 23642購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，AB 93108、AB 92006由湖南大學(xué)惠贈，其它菌株為本實驗室自行從污水廠剩余污泥、油田土壤中分離。

本研究中用到的培養(yǎng)基參見文獻(xiàn)[5]-文獻(xiàn)[10]，具體配方如下：

肉湯培養(yǎng)基[5]：牛肉浸膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1000 mL，pH = 7.0。

蔗糖培養(yǎng)基[5]：蔗糖20 g，NH4NO34.0 g，KH2PO46 g，K2HPO4·3H2O 5.24 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 1.0 mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 1.0 mg，EDTA二鈉1.4 mg，蒸餾水1000 mL，pH = 7.0。

植物油培養(yǎng)基[5]：葵花籽油4 %，NH4NO34.0 g，KH2PO46 g，K2HPO4·3H2O 5.24 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 1.0 mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 1.0 mg，EDTA二鈉1.4 mg，蒸餾水1000 mL，pH = 7.0。

種子培養(yǎng)基[6]（BPY培養(yǎng)基）：牛肉浸膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，NaCl 5.0 g，葡萄糖10.0 g，蒸餾水1000 mL，pH = 7.0。

Landy培養(yǎng)基[7]：葡萄糖20.0 g，L-谷氨酸鈉 5.0 g，MgSO40.5 g，KCl 0.5 g，KH2PO41.0 g，F(xiàn)eSO40.15 mg， MnSO45.0 mg，CuSO40.16 mg，蒸餾水1000 mL，pH = 7.0。

MMSM培養(yǎng)基[8]：葡萄糖40.0 g，NH4NO34.0 g，KH2PO44.1 g，Na2HPO4·12H2O 14.33 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.8 mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 1.1 mg，EDTA二鈉1.3 mg，蒸餾水1000 mL，pH = 7.0。

MSM培養(yǎng)基[9]：葡萄糖4.0 g，(NH4)2SO41.0 g，K2HPO4·3H2O 4.8 g，KH2PO41.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，酵母粉0.1 g，Na3C6H5O7·2H2O 0.5 g，CaCl2·2H2O 0.2 mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.2 mg，蒸餾水1000 mL，pH = 7.0。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基[10]：可溶性淀粉20.0 g，NH4NO36.0 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl2·2H2O 0.08 g，酵母粉 0.6 g，KH2PO42.0 g，Na2HPO4·12H2O 8.0 g，蒸餾水1000 mL ，pH = 7.0。

1.2 主要試劑

乙腈、甲醇、三氟乙酸均為色譜級，其他實驗用試劑為分析純，均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑產(chǎn)品。Surfactin標(biāo)樣購自美國sigma公司。

1.3 生物表面活性劑粗品的分離提取

接種一環(huán)菌體于100 mL種子培養(yǎng)基中，于28 ℃、130 rpm下培養(yǎng)12 h，再以5 %的接種量接種于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 ℃、130 rpm搖床培養(yǎng)24 h。在4 ℃、12000 rpm下將發(fā)酵液離心10 min，去除菌體，上清液用6 mol/L HCl調(diào)節(jié)至pH = 2.0，在4 ℃冰箱中放置過夜。離心收集褐色沉淀，并用pH = 2的稀鹽酸洗滌兩遍。用NaOH 溶液將沉淀物的pH 值調(diào)至7.0，冷凍干燥后待用。

1.4 生物表面活性劑粗品的純化

將冷凍干燥所得粗產(chǎn)物用CHCl3/CH3OH(體積比3:1)抽提24 h，合并萃取相，減壓蒸發(fā)去除有機(jī)相。加入正己烷洗滌3次除去脂肪酸等，離心收集沉淀物并干燥，最后用 CH2Cl2于50 ℃抽提10 h，減壓蒸發(fā)去除CH2Cl2，即得純化的生物表面活性劑，純化樣品為黃綠色晶狀物。

1.5 TLC分析

生物表面活性劑樣品溶于CH2Cl2中，點樣于兩塊硅膠板上，分別以CHCl3/CH3COOH（體積比8:2）為展開劑，薄板層析展開，吹干；其中一塊硅膠板噴灑蒸餾水顯色，另一塊噴灑茚三酮顯色劑加熱顯色。把噴灑茚三酮硅膠板放入密封容器內(nèi)，在110 ℃加熱1 h，用濃鹽酸原位水解[11]，再噴灑茚三酮顯色劑加熱顯色。

1.6 紅外光譜分析

將KBr充分研磨至顆粒直徑達(dá)到2 μm以下，再按照樣品:KBr = 1:100的比例，將純化后的生物表面活性劑與KBr混合研磨均勻，放入磨具內(nèi)壓成透明的薄片。用鑷子將薄片裝入磁性樣品架上，放入Nicolet 5700智能傅立葉紅外光譜儀的樣品室中，先測空白背景，再將樣品置于光路中，測量樣品紅外光譜圖。

1.7 高效液相色譜分析

HPLC系統(tǒng)為Waters e2695型儀器，配Water 2489紫外/可見光檢測器；色譜柱為Kromasil公司的KromasilC18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流速，0.84 mL/min；柱溫，30 ℃；檢測波長，214 nm；流動相A為水（含0.1 %TFA），流動相B為乙腈。洗脫程序：0 min，40 %A；9~30 min，7 %A。

1.8 產(chǎn)物CMC及上清液CMD的測定[12]

臨界膠束濃度(CMC)是指形成一定形狀的膠團(tuán)所需表面活性物質(zhì)的最低濃度，是表面活性劑的一個重要特征。將產(chǎn)物配成2 g/L的溶液，經(jīng)蒸餾水逐級稀釋并測定其表面張力，直至表面張力近于水的表面張力(72.0 mN/m)，記錄數(shù)據(jù)并繪制成曲線，表面張力急劇上升時的產(chǎn)物濃度即為CMC。而CMD是指將含表面活性劑的溶液不斷稀釋，表面張力突然上升時的稀釋倍數(shù)。對于某些種類和濃度尚不十分明確的生物表面活性劑，可以采用CMD來表示其活性。用DT-102型全自動張力儀于25 ℃下測定發(fā)酵液及產(chǎn)物溶液的表面張力。

1.9 乳化能力

將5 mL發(fā)酵液或產(chǎn)物溶液與5 ml煤油混合，于2500 rpm下震蕩2 min，靜置0.5、24、48 h后分別讀取乳化層高度。

2 結(jié)果與討論

2.1 生物表面活性劑產(chǎn)生菌的優(yōu)選

實驗室保藏菌株經(jīng)肉湯培養(yǎng)基活化后，分別用蔗糖和葵花籽油作為碳源發(fā)酵培養(yǎng)，3種培養(yǎng)基全培養(yǎng)液的表面張力見表1。從表面張力來看，菌株CICC 23659和菌株CICC 10275的蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基和植物油培養(yǎng)基全培養(yǎng)液明顯低于其他菌株。其中菌株CICC 23659能將蔗糖培養(yǎng)基的表面張力從61.3 mN/m降低至24.7 mN/m，將植物油培養(yǎng)基的表面張力從67.9 mN/m降低至25.5 mN/m。由此看來，菌株CICC 23659在發(fā)酵培養(yǎng)的過程中產(chǎn)生了生物表面活性劑，使得發(fā)酵液具有顯著的表面活性，后續(xù)研究選擇表面活性最高的CICC 23659作為主要對象。

表1 生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選結(jié)果

注：“/”表示該菌株尚未鑒定。

2.2 培養(yǎng)基的優(yōu)選

表2列出了菌株CICC 23659在4種不同培養(yǎng)基培養(yǎng)時產(chǎn)量及其性質(zhì)的差異。由表2可知，在相同發(fā)酵條件下，Landy培養(yǎng)基得到的生物表面活性劑粗產(chǎn)物產(chǎn)量最高，達(dá)到0.24 g/L，其次為MMSM培養(yǎng)基。但從粗產(chǎn)物的性質(zhì)來看，MMSM培養(yǎng)基得到的生物表面活性劑粗產(chǎn)物的CMC最低，為125 mg/L，因此該培養(yǎng)基上清液的CMD值最高，達(dá)到16，即上清液稀釋16倍時，表面張力仍能維持在30 mN/m左右。造成以上結(jié)果的原因可能是等電點為pH = 2左右的物質(zhì)都可能被酸析沉淀，因此酸析沉淀法得到的粗產(chǎn)物除了生物表面活性劑之外，還可能含有其它不具有表面活性的物質(zhì)，如氨基酸、蛋白質(zhì)等。盡管Landy培養(yǎng)基得到的粗產(chǎn)物質(zhì)量最大，但從CMC和CMD值來看，Landy培養(yǎng)基上清液中的表面活性物質(zhì)含量僅為MMSM培養(yǎng)基的一半。從四種培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的粗產(chǎn)物的排油圈直徑中，也可得到相同的結(jié)論。MMSM培養(yǎng)基所得粗產(chǎn)物的排油活性最大，排油圈直徑可達(dá)14 cm。而Landy培養(yǎng)基和MSM培養(yǎng)基得到的產(chǎn)物排油圈僅為MMSM培養(yǎng)基產(chǎn)物的一半，基礎(chǔ)培養(yǎng)基得到的產(chǎn)物幾乎無排油活性。

表2 不同培養(yǎng)基對表面活性劑粗產(chǎn)物產(chǎn)量及性質(zhì)的影響

由以上這些性質(zhì)可知，Landy培養(yǎng)基得到的粗產(chǎn)物量最大，但是由于粗產(chǎn)物中含有大量雜質(zhì)，導(dǎo)致CMC值很大。MMSM培養(yǎng)基得到的粗產(chǎn)物產(chǎn)量雖不是最大，但粗產(chǎn)物CMC值最小，排油活性最大。因此，MMSM培養(yǎng)基是最適合生物表面活性劑產(chǎn)生菌發(fā)酵產(chǎn)表面活性物質(zhì)的培養(yǎng)基。

2.3 生物表面活性劑的性質(zhì)

2.3.1 生物表面活性劑的排油活性

將MMSM培養(yǎng)基得到的粗產(chǎn)物配成不同濃度，考察其排油活性。結(jié)果表明，粗產(chǎn)物的活性與濃度之間成正相關(guān)，粗產(chǎn)物濃度越高排油活性越顯著（圖1）。

圖1 酸析粗產(chǎn)物的排油活性

圖2 酸析粗產(chǎn)物對各疏水性物質(zhì)的乳化作用

2.3.2 生物表面活性劑的乳化能力

將粗產(chǎn)物配成2 g/L的濃度，對不同油類進(jìn)行乳化實驗，由下圖可知，此表面活性物質(zhì)具有良好的乳化性能。除機(jī)油外，粗產(chǎn)物對各油類乳化能力均高于55 %，且靜置48 h后仍能乳化層高度基本不變（圖2）。因此粗產(chǎn)物對苯環(huán)類物質(zhì)以及中長鏈烷烴均具有很好的乳化能力并形成穩(wěn)定的乳狀液。

粗產(chǎn)物純化后得到晶體狀的生物表面活性劑純化樣品，考察其不同濃度對煤油的乳化能力。結(jié)果表明，純化得到的生物表面活性劑濃度為0.25 g/L時，對煤油的乳化能力為48 %，且48 h后乳化能力仍能維持在45 %，純化樣品具有較高的乳化能力和穩(wěn)定性。當(dāng)純化樣品濃度為0.5 g/L時，對煤油的乳化能力為60 %，且48 h后仍維持在58 %。當(dāng)純化樣品濃度低于CMC（31 mg/L）時，基本無乳化能力（圖3）。

圖3 純化產(chǎn)物對煤油的乳化作用

2.4 純化產(chǎn)物的表面張力

蒸餾水的表面張力為71.0 mN/m，粗產(chǎn)物純化后得到的樣品在蒸餾水中的CMC為31.2 mg/L，最低表面張力值為27.8 mN/m。文獻(xiàn)報道的最多的是枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的脂肽類表面活性素surfactin，它能顯著的降低水的表面張力，使其從70 mN/m下降至27 mN/m，CMC為25 mg/L，是已報道的表面活性最強(qiáng)的生物表面活性劑[13]。另外，地衣芽孢桿菌產(chǎn)生的地衣素[14]能將水的表面張力從71.8 mN/m降至35.5 mN/m，臨界膠束濃度（CMC）為30.0 mg/L。假單胞菌XD-1[15]發(fā)酵產(chǎn)生的生物表面活性劑經(jīng)鑒定為脂肽和糖脂的混合物，可將培養(yǎng)液的表面張力從70.0 mN/m降至30.2 mN/m，CMC值為50 mg/L。從最低表面張力值和CMC值來看，純化產(chǎn)物與surfactin性質(zhì)相似，還需采用其它手段驗證。

2.5 生物表面活性劑的鑒定

2.5.1 TLC鑒定

氨基酸及含有游離氨基的肽或蛋白質(zhì)能與茚三酮發(fā)生顯色反應(yīng)，是定性鑒定氨基酸和蛋白質(zhì)的重要反應(yīng)，除脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮顯黃色外，其他α-氨基酸與茚三酮隨濃度的增大顯紅色到藍(lán)紫色。

純化后樣品的TLC分析結(jié)果表明，直接噴灑蒸餾水，樣品顯白色疏水斑點，說明生物表面活性劑有疏水性成分。直接噴灑茚三酮顯色劑加熱，樣品不顯色，說明樣品中不含游離氨基。采用濃鹽酸原位酸解后，再噴灑茚三酮顯色劑加熱，樣品顯色（圖4），說明樣品經(jīng)水解后含有游離氨基。樣品顯色表明樣品為脂肽，且可能是氨基閉封的環(huán)脂肽。樣品的比移值為0.63，surfactin標(biāo)樣的比移值為0.64，可認(rèn)為樣品比移值與surfactin相同。

左圖用水顯色，右圖用茚三酮顯色；a、a’為純化樣品，b、b’為surfactin

2.5.2 紅外光譜鑒定

從生物表面活性劑的紅外光譜圖上發(fā)現(xiàn)脂肪鏈1382，1461 cm-1，酰胺鍵（肽鍵）1648，1540 cm-1，及內(nèi)酯鍵1739 cm-1的特征吸收峰，N—H 3320 cm-1，飽和C—H 2927，2856 cm-1吸收峰（圖5上）。檢索顯示，該樣品的紅外光譜與surfactin的紅外光譜（圖5下）有很好的相似性。TLC與紅外光譜數(shù)據(jù)顯示，該表面活性劑為脂肽，且無游離氨基，結(jié)合有內(nèi)酯鍵及原位水解后對茚三酮顯色的特性，肽部分應(yīng)該為環(huán)狀。

圖5 樣品（上）及surfactin（下）的紅外光譜圖

2.5.3 高效液相色譜鑒定

surfactin標(biāo)準(zhǔn)樣品在高效液相色譜圖上顯示出5個主峰（圖6），出峰時間分別為14.111 min、16.403 min、20.639 min、22.059 min和26.080 min。脂肽純化樣品經(jīng)過HPLC分離得5個主峰，出峰時間為14.684 min、16.385 min、20.683 min、22.090 min和26.006 min，分別對應(yīng)surfactin標(biāo)準(zhǔn)樣品的5個主峰。因此，從純化樣品與surfactin的高效液相色譜圖比對可知，菌株CICC 23659發(fā)酵產(chǎn)生的生物表面活性劑為surfactin。

3 結(jié)論

本試驗從22株生物表面活性劑產(chǎn)生菌中優(yōu)選出一株枯草芽孢桿菌CICC 23659，該菌株以MMSM培養(yǎng)基中得到的產(chǎn)物產(chǎn)量較高，且CMC值最小，該粗產(chǎn)物經(jīng)純化后CMC可達(dá)到31.2 mg/L，最低表面張力為27.8 mN/m。該生物表面活性劑對苯環(huán)類、中長鏈烷烴類油脂具有顯著且穩(wěn)定的乳化能力，且具有良好的排油活性，可推廣應(yīng)用于石油工業(yè)和環(huán)境工程領(lǐng)域。經(jīng)TLC、紅外光譜和高效液相鑒定，該生物表面活性劑為surfactin。

圖6 樣品（上）及surfactin（下）標(biāo)準(zhǔn)樣品的高效液相色譜圖

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SELECTION OF BIOSURFACTANT PRODUCING BACTERIUM AND STUDIES ON ITS PROPERTIES

HUANG Xiang-feng, ZHU Han,*LU Li-jun, PENG Kai-ming, ZHAN Peng-ju, LIU Jia

(State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai, 200092,China)

CICC 23659 was optimized from 22 strains of biosurfactant-producing bacteria due to its significant surface activity. The medium screening experiment indicated that CICC 23659 could obtain high yield of biosurfactant with stable emulsifying ability and oil discharge activity in MMSM. 2 g/L crude product has significant oil discharge activity, displays remarkable emulsifying ability on hydrophobic substrate such as long chain alkane or benzodiazepines and can form stable emulsion.The CMC of purified product is 31.5 mg/L, and the lowest surface tention is 27.8 mN/m. The product was identified as surfactin by TLC, IR and HPLC analysis.

; biosurfactant; emulsifying ability; surface activity; identification

1674-8085(2012)03-0052-06

Q939.124

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2012.03.011

2011-12-24；

2012-02-27

國家自然科學(xué)基金項目(51108333;50908166);中國博士后特別資助基金項目(201104284;20100480621);上海市博士后基金項目(11R21416600);教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃（NCET-10-0629）

黃翔峰(1974-)，男，福建古田人，教授，博士，主要從事水體污染控制與環(huán)境微生物研究(Email:hxf@#edu.cn);

朱 菡(1987-)，女，江蘇無錫人，碩士生，主要從事水體污染控制與環(huán)境微生物研究(Email: zhuhanxt@hotmail.com);

*陸麗君(1982-)，女，上海松江人，講師，碩士，主要從事水體污染控制與環(huán)境微生物研究(Email:lulijun@#edu.cn);

彭開銘(1987-)，男，安徽臨泉人，博士生，主要從事水體污染控制與環(huán)境微生物研究(Email:kai878@sina.com);

詹鵬舉(1989-)，男，新疆呼圖壁人，碩士生，主要從事水體污染控制與環(huán)境微生物研究(Email:zhanpengju@yahoo.com.cn);

劉 佳(1982-)，女，黑龍江齊齊哈爾人，博士，主要從事水體污染控制與環(huán)境微生物研究(Email:passsia@gmail.com).