李彩艷,趙衛(wèi)紅,苗 輝

(1.中國科學院 海洋研究所 海洋生態(tài)與環(huán)境科學重點實驗室,山東 青島 266071;2.中國科學院 研究生院,北京 100049)

多胺是生物生長的調(diào)節(jié)因子,廣泛的存在于動物[1]、植物[2]、浮游生物[3-4]和海藻中[5]。內(nèi)源性多胺可以與DNA、RNA和蛋白質(zhì)結(jié)合,對生物的生長和發(fā)育起著重要作用[1,6-9]。外源性多胺可刺激植物細胞[10]和藻細胞的分裂增殖[11-12]。常見的多胺有腐胺、亞精胺,精胺和2-苯基乙胺。

多胺還被認為可以刺激和調(diào)控赤潮[11-13]。外源多胺可以刺激赤潮藻的生長,內(nèi)源多胺對藻細胞的分裂增殖等有調(diào)節(jié)作用。腐胺和初級生產(chǎn)力存在正相關(guān)性也有報道,揭示了多胺在海洋氮循環(huán)中發(fā)揮著重要作用[14]。另外,多胺還可以加強藻毒素的毒性[15-16]。研究顯示多胺是赤潮發(fā)生的一個重要調(diào)控因子,但由于海水中多胺濃度較低以及測定方法的限制,我國還沒有海水中多胺濃度的報道。近年來,東海赤潮頻發(fā),成為我國赤潮的高發(fā)區(qū)[17],東海赤潮的發(fā)生機制成為廣大海洋科學工作者研究的熱點。本文采用高效液相色譜法測定了2010年6月東海海水中的游離態(tài)多胺含量及分布,為探究多胺在東海赤潮中的作用提供科學依據(jù)和參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 海水樣品的采集

于2010年6月8日到6月22日在長江口以及東海陸架(122.17°E～125.02°E,26.8°N～32.0°N)設(shè)置7個斷面 (圖1)?，F(xiàn)場使用采水器分別采集表層、中層、底層水樣,表層為水面下約1 m,中層為葉綠素最大層,底層為距海底 0～3 m海水樣品經(jīng) GF/F膜(450℃灼燒4 h)過濾后儲存在棕色玻璃瓶中(450℃灼燒4 h),于-20℃冷凍保存水樣。

1.2 儀器和試劑

腐胺(putrescine,≥98%)、亞精胺(spermindine,≥98%)、精胺(spermine,≥97%)和丹磺酰氯(dansyl chloride,≥99%)均購自美國 Sigma公司;乙腈和丙酮為進口色譜純試劑(Honeywell,Burdick&Jackson公司);1,6-己二胺(1,6-diaminohexane)、碳酸鈉、氫氧化鈉、硼酸鈉、氨水、乙醚均為國產(chǎn)分析純;實驗用水為Milli-Q水(≥18.2MΩ)。采用Waters e2695高效液相色譜儀和Waters e2475熒光檢測器進行測定。

1.3 海水樣品游離態(tài)多胺的測定及分析方法

樣品測定前解凍,取 1 mL的海水樣品,加入70%的高氯酸,使其濃度達到 5%,4℃冰箱放置30 min。再加入 80 μL 2 mol/L 的 NaOH 溶液和 70 μL pH 9.18的硼酸,此時pH約為9,加入1mL丹磺酰氯(6 g/L丙酮)衍生劑,渦旋混勻30 s,40℃水浴避光反應(yīng)45 min。加入40 μL 25%的濃氨水中止反應(yīng),靜置30 min。再加入60 μL乙腈,用0.22 μm有機針頭微孔濾膜過濾,最后采用高效液相色譜進樣分析[18]。

圖1 采樣站位圖Fig.1 Location of sampling stations

色譜柱為C18(150 mm×4.6 mm i.d.,5μm particle size,Agilent);熒光檢測激發(fā)波長(Ex)340 nm,發(fā)射波長(Em)515 nm;柱溫40℃;流動相A為乙腈,B為0.1 mol/L的醋酸銨(0.45 μm玻璃纖維濾膜過濾)。采用梯度洗脫,程序如下：0 min：A 35%,B 65%;0～10 min：A 35%～60%,B 65%～40%;10～15 min：A 60%～80%,B 40%～20%;15～20 min：A 80%～100%,B 20%～0;20～30 min：A 100%～35%,B 0～65%;30～35 min：A 35%,B 65%。衍生物進樣量為10 μL,流速1.0 mL/min。在該實驗條件下,2-苯基乙胺,腐胺、亞精胺、精胺得到了較好的分離,且三種胺工作曲線的相關(guān)系數(shù)都達到 0.999以上,檢測限分別為 9.3×10-11、9.6×10-11、2.8×10-10、1×10-10mol/L。

對測定后的樣品濃度采用sas9.1進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離態(tài)多胺的濃度

由表1可以看出,主要的游離態(tài)多胺為腐胺和2-苯基乙胺,占總組成的比例為62%±15%和19%±11%,其次為精胺,所占比例分別為 14%±12%,亞精胺的含量最低,僅占總組成的比例的 6%±5%。不同的站位多胺的濃度變化較大。從各層總平均值看,除腐胺外,2-苯基乙胺、亞精胺和精胺在中層濃度最高。

表1 海水中游離態(tài)多胺的濃度Tab.1 Concentrations of free polyamines in East China Sea

2.2 游離態(tài)多胺的大面分布

由圖2可以看出,2-苯基乙胺表層在長江口附近濃度較高,其次為杭州灣附近,各斷面濃度由高到低為 Dh1、Dh3、Dh4、Dha、Dh2、Dh5、Dh6;中層在杭州灣附近濃度較高,各斷面濃度由高到低為Dha、Dh3、Dh1、Dh4、Dh2、Dh6、Dh5;底層濃度較低,分布也較均勻,在調(diào)查區(qū)域的中東部出現(xiàn)高值,各斷面濃度由高到低為Dh4、Dha、Dh3、Dh1、Dh6、Dh5、Dh2。

由圖3可以看出,腐胺表層在長江口附近斷面的濃度較高,Dh2斷面濃度和其他斷面濃度差異達到顯著水平(P=0.0445),各斷面濃度由高到低依次為Dh2、Dha、Dh4、Dh5、Dh1、Dh3、Dh6;中層在長江口附近和杭州灣附近斷面濃度也較高,Dh2斷面濃度和其他斷面濃度差異達到顯著水(P=0.031),各斷面濃度由高到低依次為Dh2、Dha、Dh1、Dh6、Dh5、Dh4、Dh3;底層濃度最高,可能與生物尸體腐爛,蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生腐胺有關(guān),各斷面濃度由高到低依次為 Dh2、Dha、Dh4、Dh3、Dh5、Dh1、Dh6。

圖2 2-苯基乙胺的大面分布(nmol/L)Fig.2 Distribution of free Pea (nmol/L)

圖3 腐胺的大面分布(nmol/L)Fig.3 Distribution of free Put( nmol/L)

亞精胺的濃度在四種胺中含量最低,表層在杭州灣附近南部和長江口附近斷面的中部形成高值區(qū),各斷面濃度由高到低依次為Dh1、Dh3、Dh5、Dh2、Dh6、Dha、Dh4;中層和底層均在杭州灣附近區(qū)域出現(xiàn)高值區(qū)(圖4),中層各斷面濃度由高到低依次為Dha、Dh3、Dh1、Dh4、Dh2、Dh6、Dh5,底層各斷面濃度由高到低依次為Dh2、Dha、Dh4、Dh3、Dh5、Dh1、Dh6。

圖4 亞精胺的大面分布(nmol/L)Fig.4 Distribution of free Spd (nmol/L)

精胺表層在調(diào)查區(qū)域的西南部出現(xiàn)高值區(qū),而長江口近岸附近濃度較低(圖5),各斷面濃度由高到低依次為 Dh6、Dh1、Dh5、Dh4、Dh3、Dh2、Dha;中層長江口附近濃度較低,而在調(diào)查區(qū)域的東部濃度較高,各斷面濃度由高到低依次為 Dh5、Dh1、Dh6、Dh3、Dh2、Dha、Dh4;底層分布和中層較為相似,在調(diào)查區(qū)域的東南部出現(xiàn)高值,各斷面濃度由高到低依次為 Dh5、Dh6、Dha、Dh3、Dh1、Dh4、Dh2。

圖5 精胺的大面分布(nmol/L)Fig.5 Distribution of free Spm (nmol/L)

2.3 游離態(tài)多胺在各斷面的垂直分布

由表2可以看出,2-苯基乙胺在Dh2和Dh3斷面的垂直分布形式為中層＞表層＞底層;Dha和Dh6的分布形式為中層＞底層＞表層;Dh4和 Dh5的分布形式均為底層＞中層;除Dh4和Dh5外,2-苯基乙胺在其他斷面的中層濃度均高于底層濃度。各斷面濃度的總體平均值由高到低依次為Dha、Dh3、Dh4、Dh1、Dh2、Dh6、Dh5。

表2 2-苯基乙胺在各斷面垂直分布Tab.2 The vertical distribution of Pea in 7 sections

由表3可以看出,腐胺在Dh3和Dha斷面的垂直分布形式為底層＞中層＞表層;Dh4和 Dh5的垂直分布形式為底層＞表層＞中層;Dh1、Dh2和Dh6的垂直分布形式為中層＞底層。除Dh1和Dh2外,腐胺大多數(shù)斷面的底層濃度高于表層濃度。Dh2斷面的腐胺濃度平均值可達27.37 nmol/L±14.22 nmol/L,顯著高于其他斷面(p＜0.001),各斷面濃度的總體平均值由高到低依次為 Dh2、Dha、Dh4、Dh1、Dh5、Dh3、Dh6。

由表4可以看出,亞精胺在Dh1、Dh3、Dh5斷面的垂直分布均為表層＞中層＞底層;Dh4和 Dh6的垂直分布均為底層＞中層＞表層;除 Dh4和 Dh6外,亞精胺大多數(shù)斷面的中層濃度高于底層。各斷面濃度的總體平均值由高到低依次為 Dha、Dh3、Dh1、Dh5、Dh6、Dh4、Dh2。

由表5可以看出,精胺在Dh1和Dha斷面的垂直分布為中層＞表層＞底層;Dh2、Dh4、Dh6斷面的垂直分布為表層＞中層＞底層;Dh3和 Dh5的垂直分布為中層＞底層＞表層;精胺在所有斷面的中層濃度都高于底層。各斷面濃度的總體平均值由高到低依次為 Dh5、Dh6、Dh1、Dh3、Dh4、Dh2、Dha。

3 討論

6月份海水中游離態(tài)腐胺的濃度最高,亞精胺的濃度最低。Nishibori發(fā)現(xiàn)日本瀨戶內(nèi)海以亞精胺和腐胺為主,濃度分別為 0～4.4 nmol/L和 0～2.8 nmol/L[19]。Badini等[20]在研究亞得里亞海時發(fā)現(xiàn)海水中腐胺和亞精胺的濃度分別為 0～0.57 μmol/L和0～0.92 μmol/L,精胺為 0～0.02 μmol/L。2010 年4、5月份東海海水中主要的游離態(tài)多胺為精胺,由此可見,不同的海水樣品多胺的濃度差異較大,同一區(qū)域海水在不同季節(jié)多胺濃度的差異也較大。

表3 腐胺在各斷面的垂直分布Tab.3 The vertical distribution of Put in 7 sections

表4 亞精胺在各斷面的垂直分布Tab.4 The vertical distribution of Spd in 7 sections

表5 精胺在各斷面的垂直分布Tab.5 The vertical distribution of Spm in 7 sections

航次調(diào)查期間在 Dh1-3站位出現(xiàn)夜光藻赤潮,該站位亞精胺表層濃度達到 4.87 nmol/L,精胺表層和中層濃度分別為8.58 nmol/L 和11.98 nmol/L,遠高于總體平均值。對4、5月份東海赤潮高發(fā)區(qū)的調(diào)查顯示,2010年東海春季赤潮爆發(fā)區(qū)域的多胺的濃度大都較高,這與日本學者發(fā)現(xiàn)的瀨戶內(nèi)海浮游植物大量繁殖區(qū)域多胺濃度較高一致[19]。

多胺的產(chǎn)生有三個條件,一是有可利用的自由氨基酸,二是有能分泌氨基酸脫羧酶的微生物存在;三是有適宜的環(huán)境條件,利于細菌的生長、脫羧酶的合成和提高脫羧酶活性[21]。氨基酸在適宜的條件下可直接轉(zhuǎn)化為腐胺,腐胺再進一步轉(zhuǎn)化生成亞精胺、精胺等。海洋環(huán)境中多胺的來源主要有以下四種途徑：①死魚及其他有機體的分解。在魚類及其他有機體死亡后,蛋白質(zhì)可被微生物降解成游離態(tài)的氨基酸,經(jīng)過脫羧而形成相應(yīng)的多胺。②生物在代謝過程中也會產(chǎn)生多胺類物質(zhì),例如魚類、藻類等。③赤潮藻在消亡期會釋放大量多胺。④外源輸入。養(yǎng)殖廢水等富含腐敗蛋白質(zhì)的廢水排入大海,能產(chǎn)生多種可被藻類吸收的生物活性物質(zhì),包括多胺。但多胺極不穩(wěn)定,光度較強、溫度較高等,都會造成多胺的分解。另外,多胺可以被藻體等生物吸收、降解。因此海水中的多胺濃度會受到潮流、光照、溫度、營養(yǎng)物質(zhì)、生物等多種因素的影響。

從實驗結(jié)果可以看出,2-苯基乙胺表層、腐胺和亞精胺表中底層均在長江口附近區(qū)域出現(xiàn)高值,這可能和長江沖淡水有關(guān),一方面陸源物質(zhì)中可能含有多胺以及多胺合成所需的氨基酸等,另一方面,該海區(qū)夏季適宜的光照和溫度,使浮游植物大量繁殖[22],生物體在代謝過程中會釋放多胺。2-苯基乙胺表中層、亞精胺表中底層及精胺的表層均在杭州灣附近區(qū)域出現(xiàn)高值,可能和該海區(qū)上升流的涌升帶來豐富的營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān),該區(qū)域也比較適合浮游植物的生長。這兩個區(qū)域均為赤潮的高發(fā)區(qū),由此可見,赤潮高發(fā)區(qū)夏季的多胺濃度也較高。

從總平均值看,2-苯基乙胺、亞精胺和精胺在中層的濃度最大,這可能是由于中層為葉綠素最大層,生物代謝旺盛,會像環(huán)境中釋放多胺。大多數(shù)斷面2-苯基乙胺、亞精胺和精胺的中層濃度均高于底層濃度可能也是這一緣故。腐胺在大多數(shù)斷面的底層濃度高于表層濃度,可能是海底沉積物中含有蛋白質(zhì)等,蛋白質(zhì)降解時產(chǎn)生多胺,從而導致多胺濃度較高。

4 結(jié)論

我國東海海水中 6月份腐胺的含量最高,亞精胺的含量最低,占總組成的比例分別為 62%±15%和6%±5%。從大面分布看,四種游離態(tài)多胺的高值大都出現(xiàn)在長江口及杭州灣附近區(qū)域。從各斷面的垂直分布看,2-苯基乙胺、亞精胺和精胺在大多數(shù)斷面的中層濃度均高于底層濃度。腐胺在大多數(shù)斷面的底層濃度高于表層濃度。夜光藻赤潮爆發(fā)處多胺的濃度相對較高。

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