于永忠，郭雯，吳欣媛，王金珍，崔玉東

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

羊口瘡（Orf）又稱羊傳染性膿皰（Contagious Ecthyma）是由羊口瘡病毒（ORFV）引起的一種急性的、接觸性的、高度嗜上皮性傳染病，該病以在綿羊、山羊等動(dòng)物的口唇、舌、鼻、乳房等部位形成丘疹、水皰、膿皰和結(jié)成疣狀結(jié)痂為特征，主要引起皮膚和黏膜的增生性病變[1-2]。目前，該病幾乎分布于世界所有養(yǎng)羊的國(guó)家和地區(qū)，同時(shí)也有人員感染的報(bào)道[3-4]。由于Orf在防治上缺乏有效的疫苗，而RNA干擾技術(shù)可能成為的抑制目的基因表達(dá)，控制病毒復(fù)制的有效手段。1998年，F(xiàn)ire等人發(fā)現(xiàn)dsRNA（Double strand RNA）能夠比反義RNA或順義RNA更有效地關(guān)閉基因的表達(dá)，稱這種現(xiàn)象為RNA干涉（RNA interference，RNAi）[5]，并推測(cè)RNAi可能廣泛存在于各種生物體中，是生物進(jìn)化過(guò)程中一種重要防御機(jī)制。RNAi作為一種新的基因阻斷技術(shù)，具有特異、有效的基因沉默效應(yīng)，能夠簡(jiǎn)單、高效地阻抑特定基因表達(dá)，現(xiàn)已廣泛用于抗腫瘤，抗病毒的基因治療，RNAi及其相關(guān)的RNA基因沉默機(jī)制被認(rèn)為在抵御病毒入侵和轉(zhuǎn)座子表達(dá)中起到關(guān)鍵性的作用[6]。由于在病毒中利用RNAi技術(shù)仍需要通過(guò)轉(zhuǎn)化載體導(dǎo)入能產(chǎn)生發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA（Short-hairpin RNA，shRNA）或dsRNA的表達(dá)單位，方便有效的RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建成為高效利用RNAi技術(shù)的關(guān)鍵。DNA ploymerase基因是ORFV復(fù)制的關(guān)鍵性基因，如果對(duì)于該基因能夠運(yùn)用RNAi技術(shù)加以體內(nèi)沉默，無(wú)疑會(huì)為Orf的防控開(kāi)辟新的思路，由此，研究目的是利用慢病毒載體（Lentiviru vector）pLL3.7包裝質(zhì)粒構(gòu)建pLL3.7-hsRNA系統(tǒng)，從而為體外獲得靶向DNA ploymerase基因的 siRNA（Small interfering RNA）片段重組載體提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株與載體 羊口瘡病毒ORFV（OV/HLJ/04）株由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科技學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；表達(dá)載體pLL3.7由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院連正興教授惠贈(zèng)。

1.1.2 試劑 胎牛血清FBS、改良型RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自于Soarbio公司；T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、HpaⅠ購(gòu)自Promega公司；LA-TaqDNA聚合酶、氨芐青霉素為TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司的產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 方法

1.2.1 shRNA設(shè)計(jì)與制備

根據(jù)GenBank公布的DNA聚合酶序列利用在線軟件 （https：//rnaidesigner.invitrogen.com） 設(shè)計(jì)shRNA，并將靶序列通過(guò)基因BLAST分析以排除siRNA非特異性抑制其他基因的可能并選出分值較高的3個(gè)候選片段，起始點(diǎn)分別為596、875和947，分別命名為D-875、D-947和D-596，如表1所示。一般構(gòu)成模式為：正義 TG sen TTCAAGAGA anti CTTTTTTC（HpaⅠ）；反義TCGAG AAAAAAG sen TCTCTTGAA anti CA（XhoⅠ）。TTCAAGAGA能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；每個(gè)片段設(shè)置XhoⅠ和Hp aⅠ位點(diǎn)。各互補(bǔ)單鏈由上海生工公司合成。將合成好的單鏈用ddH2O溶解，終濃度為10 nmol·Μl-1。正義、反義鏈各取10μl或20μl等量混合后，煮沸2～3min，使其自然冷卻至室溫，4℃保存。

1.2.2 pLL3.7-shRNA質(zhì)粒構(gòu)建

pLL3.7質(zhì)粒經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，使用XhoⅠ和HpaⅠ37℃雙酶切3～4 h，80℃滅活20min。取少量電泳鑒定。將制備好的shRNA片段與酶切后的pLL3.7質(zhì)粒，以T4連接酶22℃連接1 h。取少量電泳鑒定。然后將構(gòu)建完的pLL3.7-shRNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21。挑菌落搖培后采用菌液PCR鑒定，兩條引物分別為F：GGAAACTCACCCTAACTGTAAAG；R：GACCTGCTGCTGGAATCTCGT。鑒定正確后，用質(zhì)粒提取試劑盒小提質(zhì)粒，酶切鑒定。鑒定正確后送上海生物工程公司測(cè)序。

表1 OFRV的DNA聚合酶基因RNAi的shRNA片段設(shè)計(jì)Table 1 shRNA fragment de sign of DNA Polymerase ge ne RNAiof OFRV

圖1 pLL3.7-shRNA重組質(zhì)粒模式圖Fig.1 Pattern of recombinant plasmids

2 結(jié)果

2.1 pLL3.7質(zhì)粒的鑒定結(jié)果

將慢病毒質(zhì)粒pLL3.7進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，在對(duì)照存在的情況下，pLL3.7的大小為7 650 bp，與對(duì)照質(zhì)粒大小一致。如圖2所示。

圖2 pLL3.7瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果Fig.2 Agarose gel electrophoresis results of pLL3.7 vector

2.2 pLL3.7質(zhì)粒載體的酶切及DNA連接鑒定結(jié)果

將質(zhì)粒熱轉(zhuǎn)化至x-LIBlue大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，37℃搖床中振蕩培養(yǎng)過(guò)夜后，提取質(zhì)粒，用XhoⅠ和HpaⅠ進(jìn)行雙酶切，使用DNA純化/回收試劑盒回收質(zhì)粒。雙酶切后的pLL3.7載體大小為7 650 bp，酶切鑒定結(jié)果如圖3所示。將pLL3.7載體分別與D-875、D-947和D-596連接，然后取少量進(jìn)行電泳鑒定，結(jié)果如圖4所示。

圖3 質(zhì)粒pLL3.7雙酶切鑒定結(jié)果Fig.3 Agarose gel electrophoresis results of pLL3.7 vector digested by XhoⅠand HpaⅠ

圖4 重組質(zhì)粒pLL3.7鑒定結(jié)果Fig.4 Agarose gel electrophoresis results of recombinant plasmid pLL3.7

2.3 重組菌抗性篩選結(jié)果

將構(gòu)建完的pLL3.7-shRNA分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，次日觀察轉(zhuǎn)化結(jié)果。挑菌落37℃搖培4～5 h后采用菌液PCR鑒定插入片段，兩條引物分別為F：GGAAACTCACCCTAACTGTAAAG；R：GACCTGCT GCTGGAATCTCGT。PCR產(chǎn)物電泳鑒定結(jié)果如圖5所示，提示重組表達(dá)載體Sh-pLL3.7-D596符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果（比未插入者多出60 bp左右）。用質(zhì)粒提取試劑盒小提質(zhì)粒，送測(cè)序。如果序列準(zhǔn)確可以用于轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。

圖5 插入片段的PCR鑒定結(jié)果Fig.5 PCR result of the inserted fragments

3 討論

目前，慢病毒載體已被廣泛地應(yīng)用于表達(dá)RNAi的研究中[7-9]。采用這種事先在體外構(gòu)建能夠表達(dá)shRNA的載體，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄shRNA的策略，不但使脂質(zhì)體有效轉(zhuǎn)染的細(xì)胞種類增加，而且對(duì)基因表達(dá)抑制效果也不遜色于體外合成shRNA試驗(yàn)效果，在長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)載體的細(xì)胞中，甚至可以發(fā)揮長(zhǎng)期阻斷基因表達(dá)的作用。然而，作為一個(gè)新興的、機(jī)制尚未完全清楚的新技術(shù)，RNAi技術(shù)發(fā)展需要關(guān)注以下幾點(diǎn)：（1）網(wǎng)上資源的差異性對(duì)于siRNA設(shè)計(jì)的優(yōu)劣、病毒基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的可獲得性及準(zhǔn)確性的潛在影響。據(jù)Snover[11]的報(bào)道，發(fā)表過(guò)的359段siRNA序列中有75%存在誘發(fā)非特異性效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。（2）客觀存在的不確定因素造成的數(shù)據(jù)偏差，比如同一段靶mRNA不同位置的相應(yīng)siRNA其基因沉默效率顯著不同[10]。實(shí)際上，與商業(yè)的siRNA或通過(guò)獨(dú)立的正義和反義RNA片斷形成dsRNA或shRNAs轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生RNAi效應(yīng)相比，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生siRNA誘導(dǎo)的RNAi有著更長(zhǎng)效的基因沉默效應(yīng)[11]。現(xiàn)在，為大幅提高PCR的特異性和效率，降落（touch down，TD）PCR技術(shù)已經(jīng)大量地進(jìn)入醫(yī)療臨床應(yīng)用。以高通量PCR為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法、如人HLA分型大多采用這一技術(shù)。采用該技術(shù)，李玉恒等所建立的TD-PCR法，可檢出極低濃度的核酸，如此高的靈敏性將會(huì)準(zhǔn)確顯示不同環(huán)境下不同組織中CIRP含量的微小變化[12]。研究通過(guò)Invitrogen網(wǎng)絡(luò)自動(dòng)設(shè)計(jì)平臺(tái)篩選并合成了3個(gè)shRNA片段互補(bǔ)單鏈，將該靶序列Oligo DNA退火，并分別與含有U6啟動(dòng)子的pLL3.7慢病毒載體質(zhì)粒構(gòu)建重組載體，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，最終獲得一個(gè)陽(yáng)性重組子pLL3.7-D596，進(jìn)一步測(cè)序結(jié)果顯示正確。pLL3.7慢病毒載體系統(tǒng)的U6啟動(dòng)子自身元素均位于轉(zhuǎn)錄區(qū)的上游，適合于表達(dá)大約21 ntRNA和大約50 ntRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)（Stem loop）。同時(shí)在包裝成功后，感染細(xì)胞時(shí)病毒可表達(dá)EGFP，有利于測(cè)定其病毒滴度，并有利于檢測(cè)其感染效率。研究從轉(zhuǎn)化結(jié)果來(lái)看，轉(zhuǎn)化效果并不理想，需要進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法和條件。此外，陽(yáng)性重組子pLL3.7-D596比pLL3.7-D947和pLL3.7-D875明顯增加幾十個(gè)核苷酸，在結(jié)果判定時(shí)容易辨別。

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