靳明武，張洋龍，涂飛，邵光喜，周玉龍，倪宏波

（1.黑龍江農(nóng)墾總局九三管理局畜牧獸醫(yī)局，嫩江161441；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院）

近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，豬病多以病原的多重感染或混合感染為主要的流行形式，豬群發(fā)病往往不是由單一病原所致，而是以兩種以上的病原體相互協(xié)同作用所造成的。這樣常常導致豬群的高發(fā)病率和高死亡率，危害極其嚴重，而且控制難度大[1]。仔豬輪狀病毒性腹瀉是由豬輪狀病毒引起的急性腸道傳染病，是危害養(yǎng)豬業(yè)的主要疾病之一。輪狀病毒屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，是各種幼齡動物非細菌性腹瀉的主要病原之一[2-3]。豬輪狀病毒感染是主要以仔豬厭食、嘔吐、腹瀉、脫水和酸堿平衡紊亂為特征性癥狀的疾病[4]。1968年美國的Mebus等首次從犢牛糞便中分離出輪狀病毒[5]，1973年澳大利亞學者Bishop，在胃腸炎患者的十二指腸超薄切片中也發(fā)現(xiàn)輪狀病毒，該病毒是引起嬰兒及多種幼齡動物非菌性腹瀉的主要病原[6]。目前，該病在我國和世界各養(yǎng)豬國家普遍存在，其造成的直接或間接經(jīng)濟損失也非常巨大。

2012年4月，北京市大興區(qū)某豬場發(fā)病，根據(jù)其臨床癥狀和剖解變化懷疑有輪狀病毒感染，采集肝、脾、腸、腎、淋巴結(jié)等病料進行實驗室診斷，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料

北京一豬場送來一只病死仔豬，無菌采集其肝、脾、腸、腎、淋巴結(jié)等。

1.1.2 試劑

Marker DL 2000購自大連寶生物工程有限公司，TIANamp Genomic DNA Kit DNA提取盒購自TIANGEN公司，PCR Master Mix緩沖液，RNeasy Plus Mini Handbook RNA提取盒購自QIAGEN公司，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄盒購自MBI公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 引物設計

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的豬巴氏桿菌、豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒、豬瘟病毒、傳染性胃腸炎病毒、流行性腹瀉病毒、輪狀病毒基因序列設計特異引物。豬巴氏桿菌：F5′-AGGGCACGCAGGCGGACTTTTA-3′，R5′-ATCGACAGCGTTTACAGCGTGGA-3′；豬鏈球菌：F5′-GATAGATGACGGTTCTTCAGATT-3′，R5′-TCCTCT CCTAACCACTGTTCAG-3′；副豬嗜血桿菌F5′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3′，R5′-GGCTTCGTC ACCCTCTCTGT-3′；胸膜肺炎放線桿菌F5′-AAGGTT GATATGTCCGCACC-3′，R5′-CACCGATTACGCCTTG CCA-3′；豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒 F5′-GCAAGCAGCAAAAGAAAAAGAAGG-3′，R5′-GCGT CGGCAAACTAAACTCCACAG-3′；豬瘟病毒 F5′-GCTCCTGGTTGGTAACCTCGG-3′，R5′-TGATGCTGT CACACAGGTGAA-3′；傳染性胃腸炎病毒 F5′-CAACCCTGAAACTAACGCAATTCT-3′，R5′-GCCCAT CCAGTCGCACTACTT-3′；流行性腹瀉病毒 F5′-AGGAACGTGACCTYAAAGACATCCC-3′，R5′-CCAG GATAAGCCGGTCTAACATTG-3′；輪狀病毒 F5′-AAATCCGCAACTATACTGTGACTA-3′，R5′-AAATC CGCAACTATACTGTGACTA-3′。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離鑒定

1.2.1.1 細菌分離純化

無菌剪取一小塊深部組織臟器，分別接種涂抹于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和5%血瓊脂培養(yǎng)基上，分別做需氧和厭氧培養(yǎng)，置37℃恒溫箱中24 h，觀察菌落形態(tài)和溶血情況等。挑取疑似菌的單個菌落進行純培養(yǎng)，劃線于5%兔血瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫箱中需氧培養(yǎng)24 h。

1.2.1.2 革蘭氏染色

利用革蘭氏染色技術(shù)在油鏡下觀察細菌的形態(tài)及顏色，紫色的是革蘭氏陽性菌，紅色的是革蘭氏陰性菌。

1.2.1.3 細菌DNA粗提取

挑取各個不同形態(tài)、大小、顏色的菌落懸浮于含100μL超純水的1.5 mL離心管中，震蕩混勻，煮沸10 min后置于冰上冷卻2 min，12 000 r·min-1離心2 min，取上清液作為PCR反應的粗制DNA模板，置-20℃保存。

1.2.2 病毒鑒定

剪取該病例的心、肝、脾、肺、腎、腸、淋巴結(jié)各一小塊，用組織研磨器研磨后，用生理鹽水重懸。然后進行以下操作：

1.2.2.1 組織DNA提?。喊凑誘IANamp Genomic DNA Kit DNA提取盒（購自TIANGEN公司）上面的步驟說明進行操作。

1.2.2.2 組織 RNA提?。喊凑?RNeasy Plus Mini Handbook RNA提取盒（購自QIAGEN公司）上面的步驟說明進行操作。

1.2.2.3 RNA反轉(zhuǎn)錄：按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄盒（購自MBI公司）上面的步驟說明進行操作。

1.2.3 PCR擴增

以實驗室分離得到的DNA和cDNA為模板，豬巴氏桿菌、豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、輪狀病毒、流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒的特異性引物為引物進行PCR反應擴增，擴增體系如下：PCR Master Mix12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板DNA1μL，加去離子水補至25μL。PCR反應程序：95℃預變性5 min，94℃變性30 s，退火30 s（巴氏桿菌56.5℃，豬鏈球菌54℃，副豬嗜血桿菌60℃，胸膜肺炎放線桿菌60℃，豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒57℃，圓環(huán)病毒52℃，豬瘟病毒60℃，傳染性胃腸炎病毒、流行性腹瀉病毒、輪狀病毒三重PCR退火溫度51℃），72℃延伸30 s，30個循環(huán)，最后72℃終延伸10min。

1.2.4 PCR產(chǎn)物檢測

取5μL擴增產(chǎn)物加入點樣孔，以165 V電壓進行1%瓊脂糖凝膠（含1%溴化乙錠2μL）電泳。電泳液用1×TAE緩沖液。25min后在紫外燈下觀察擴增結(jié)果，并一次成像拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀

患病豬病初食欲不振，精神沉郁，出現(xiàn)嘔吐和腹瀉，糞便成水樣、糊狀或似乳清樣液體，糞便呈黃綠色、灰白色或黑褐色，下痢病豬出現(xiàn)嚴重的脫水和體重下降。

2.2 病理學診斷

病變主要限于消化道，胃弛緩，內(nèi)充滿凝乳塊和乳汁，小腸壁變薄，呈半透明狀，腸內(nèi)容物呈漿性或水樣，灰白或灰黑色，腸系膜淋巴結(jié)水腫，膽囊腫大，腸絨毛萎縮。

2.3 實驗室診斷

2.3.1 細菌的分離

從肝、脾、肺、腎、腸、淋巴結(jié)組織中分離的各得到兩種細菌，根據(jù)菌落形態(tài)、大小以及顏色等初步確定有三種細菌感染，其中一種在血平板菌落較大，呈小水滴一樣，無溶血現(xiàn)象，菌落為黏液型，略帶熒光；另一種菌落在血平板上位針尖般大小，呈β溶血，菌落顏色為類白色；還有一種在血平板上菌落呈圓形，較大，表面光滑、濕潤，灰白色。將三種菌落接種到麥克凱培養(yǎng)基上，第一種和第二種菌落均不生長，第三種菌落在麥克凱培養(yǎng)基上形成紅色菌落。再進一步將第三種菌接種到伊紅美藍培養(yǎng)基上，可見黑色帶金屬光澤的菌落。由此可確定第三種菌為大腸桿菌。

2.3.2 革蘭氏染色

將分離純化的細菌進行革蘭氏染色、涂片、鏡檢?？梢姷谝环N菌兩端鈍圓紅色桿狀菌，兩極著色，無鞭毛，不形成芽胞，大小約為0.25 um～0.4 um× 0.5 um～2.5 um革蘭氏陰性菌；第二種菌也是一種兩極著色的紅色短桿菌，有莢膜和鞭毛，具有運動型。第三種菌紅色短桿菌，兩端鈍圓，散在或成對分布，有鞭毛，無芽胞，大小約為0.4 um～0.7 um×2 um～3 um革蘭氏陰性。

2.3.3 PCR

2.3.3.1 細菌PCR

對純培養(yǎng)的細菌做菌落PCR，分別選用放線桿菌、巴氏桿菌的特異性引物，對細菌進行PCR鑒定。PCR結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1號泳道有一條約450 bp的特異條帶，與放線桿菌預期目的片段大小相符；3號泳道有一條約250 bp的特異條帶，與巴氏桿菌預期目的片段相符（如圖1）。

2.3.3.2 病毒PCR

以組織中提取的病毒DNA以及病毒RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，選用輪狀病毒的特異性引物，對病毒進行PCR鑒定。PCR結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1號泳道有一條約400 bp的特異條帶，與輪狀病毒預期目的片段大小相符（如圖2）。

圖1 細菌PCR結(jié)果Fig.1 The results of bacterial PCR

圖2 病毒PCR結(jié)果Fig.2 The results of Virus PCR

3 討論

通過對該豬場的病料進行的病原學檢測和病原的分離與鑒定，和PCR等實驗結(jié)果表明，該豬場送檢的病死豬感染了輪狀病毒、大腸桿菌、巴氏桿菌、放線桿菌病。由于該病例送檢前主要表現(xiàn)出的是消化道癥狀，因此，在剖檢時，我們主要觀察的也是消化道方面的病理變化，但在肺臟等器官并無明顯的病理變化。且實驗室采取的是無菌剖檢，并在分離時也是采取的無菌操作，因此斷定放線桿菌和巴氏桿菌是該病例本身所帶菌，但還未致病或還未表現(xiàn)出明顯的癥狀和病理變化。另外，還對大腸桿菌進行了致病性實驗，將分離到的大腸桿菌腹腔注射到小鼠體內(nèi)，小鼠大面積死亡，因此，判定該種大腸桿菌為致病性大腸桿菌。

豬輪狀病毒感染也是仔豬腹瀉的重要原因之一，輪狀病毒主要存在于病豬及帶毒豬的消化道內(nèi)，病豬排出糞便污染飼料、飲水和各種用具，成為本病傳染的重要因素。輪狀病毒本病多發(fā)生在晚秋、冬季和早春季節(jié)，應激因素，特別是寒冷、潮濕、不良的衛(wèi)生生條件，對該病的嚴重程度和病死率均有較大影響，加強飼養(yǎng)管理，保持欄舍清潔衛(wèi)生，可減少環(huán)境中的病毒含量，也可以防止一些病毒和細菌的繼發(fā)感染，減少發(fā)病的機會。然而豬的放線桿菌感染經(jīng)常被豬場所忽視，豬放線桿菌可引起豬的敗血癥和死亡，豬放線桿菌屬于條件性致病菌，常存在于健康豬的扁桃體和上呼吸道，主要通過損傷的黏膜或皮膚感染。對于豬巴氏桿菌，因為一定程度上是一種條件性致病菌，平時嚴格的飼養(yǎng)管理非常重要，合理搭配日糧、營養(yǎng)平衡，注意通風、保暖，干燥、減少應激，增強抵抗力非常關(guān)鍵[7-8]。

因此，總的來說，豬場控制該類疾病，首先應該加強飼養(yǎng)管理制度，保持豬舍溫暖、干燥、通風、清潔，經(jīng)常對豬圈消毒，加強光照、降低豬舍濕度、注意防寒保暖，增強母豬和仔豬的抵抗力，產(chǎn)子后，盡量使仔豬及早吃到初乳，因為初乳和乳汁中含有一定量的保護性抗體，仔豬吃到初乳后可獲得一定的抵抗力，能減少發(fā)病和減輕發(fā)病癥狀。實行全進全出的管理模式，堅持自繁自養(yǎng)不從疫區(qū)購豬，新引進豬隔離觀察1個月后健康，方可合群。進行預防接種，每年定期進行有計劃免疫注射。發(fā)現(xiàn)病豬立即隔離到清潔、消毒、干燥和溫暖的豬舍中。其次應該對原來的免疫程序不斷的探索和改進，找出一個最適合的免疫程序按時、按質(zhì)做好豬的免疫注射工作。最后，防制上應樹立“防重于治、養(yǎng)重于防、養(yǎng)防結(jié)合”的觀念，采取環(huán)境控制、管理，疫苗和藥物預防相結(jié)合的綜合防控措施，控制疾病的發(fā)生，切實做好疾病防疫工作，規(guī)范制度，定期消毒和免疫接種對這些病將起到很好的控制作用。

［1］王永輝.規(guī)?；i場管理中存在的問題及建議［J］.今日畜牧獸醫(yī)，2011，（4）：18-20.

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