夏偉，李鵬

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶163319；2.哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司）

豬氣喘病又稱為豬支原體肺炎（Mycoplasma hyopneumoniae of swine，MPS），它是由肺炎支原體（Mycopl asma hy op neumoni ae，Mhp）引起的一種慢性接觸性呼吸道傳染病[1]。我國已將該病列入二類動物疫病。Mhp可通過空氣傳染，很難隔離和阻斷傳播途徑，且豬群的感染率很高。Mhp感染豬后，引起豬呼吸道上皮纖毛細胞的脫落，成為誘導(dǎo)疾病，特別是其他免疫缺陷性疾病發(fā)生的重要因子，從而使得疫苗的免疫效力減弱或引起免疫失敗，在全世界流行十分廣泛，是危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴重的疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失[2]。

目前豬支原體體外分離培養(yǎng)和鑒定具有一定的困難，所以在發(fā)展中國家及我國臨床條件有限的地區(qū)建立一種簡單、快速的診斷方法就尤為重要[3]，雖然現(xiàn)在該病有很多診斷方法，但是都需要較高的實驗室條件，因此在臨床上建立一種簡單、快速的診斷方法具有重要實踐意義[3]。2000年，Notomi等[4]提出的一種新的核酸擴增技術(shù)——環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP），它是一種通過設(shè)計四條特異性引物來鑒定目的基因的方法，而且它還是一種快速、簡便、準確和廉價的基因擴增法，在全世界很多發(fā)展中國家和臨床條件有限的地方被廣泛的應(yīng)用。研究主要應(yīng)用建立的豬肺炎支原體LAMP診斷方法[5]對從黑龍江省多個地區(qū)養(yǎng)豬場所采集的患豬呼吸道病的肺臟病料和健康豬鼻拭子進行檢測，試圖了解該法在豬支原體肺炎臨床診斷中的可行性，了解黑龍江省主要養(yǎng)豬密集地區(qū)的豬支原體肺炎發(fā)病情況，并進一步分析其流行病學(xué)規(guī)律，為黑龍江豬呼吸道病防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

Bst DNA聚合酶購自NEB生物技術(shù)有限公司；LA taq酶、dNTP+、DNA Marker 2000、pMD18-T載體購自大連寶生物工程有限公司；凝膠回收試劑盒、基因組DNA提取試劑盒，加拿大BBI公司產(chǎn)品，其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 待檢病料處理和模板DNA提取

待檢病料是從黑龍江省不同地區(qū)多個養(yǎng)豬場采集或送檢的患呼吸道病豬肺臟病料及健康豬鼻拭子等。待檢豬的肺臟置于-20℃保存。將TE緩沖液按1∶10加入組織中，研磨成懸液，裝入滅菌的1.5mL Effendorf管中，于-20℃反復(fù)凍融三次，在高速冷凍離心機上，以3 000 r·min-1，離心10min，取上清250μL備用。鼻拭子以0.5mL緩沖液洗下，加0.5%SDS及0.2 g·L-1蛋白酶K，55℃水浴2 h，酚：氯仿抽提，冷乙醇沉淀DNA并以10 uL溶解，純化后的DNA于-80℃保存。以上均可用基因組DNA提取試劑盒按照說明書操作。

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中Mh核苷酸序列（AF540381），利用Oligo6.71軟件設(shè)計了4條特異性引物，并由上海生物工程有限公司合成，均稀釋到10 pmol·μL-1，其引物如表1：

表1 豬肺炎支原體LAMP引物Table 1 Swinemycoplasma hyopneumoniae LAMP primer

1.4 LAMP擴增最佳反應(yīng)體系（表2）

反應(yīng)體系配制好后瞬時離心，放入水浴鍋60℃下反應(yīng)60min、85℃反應(yīng)5min即可。具體操作參照李鵬等[5]的方法進行。

表2 LAMP擴增反應(yīng)體系Table 2 LAMP amplification reaction system

1.5 LAMP重復(fù)性試驗

全部的待檢樣本均重檢一次。

2 結(jié)果

2.1 病料的M h檢測

實驗應(yīng)用LAMP技術(shù)共檢測了64份患呼吸道病的豬肺臟病料，其中54份為陽性，占84.2%，表3為LAMP對各病料的檢測結(jié)果。

表3 LAMP檢測肺炎支原體陽性結(jié)果Table 3 Mycoplasma hyopneumoniae positive results detected by LAMP

2.2 健康豬鼻拭子的檢測

共檢測健康豬鼻拭子共176份，支原體陽性數(shù)為157份，陽性率為89.2%。

表4 LAM P對健康豬鼻拭子的檢測結(jié)果Table 4 LAMP test results of nasal swabs of healthy pigs

2.3 重復(fù)性試驗

全部材料重復(fù)檢測一次，結(jié)果一致。

3 討論

豬氣喘病又稱為豬支原體肺炎（Mycoplasma hyopneumoniae of swine，MPS），此病是長期以來在豬場中難以凈化的一種疾病。尤其近年來研究發(fā)現(xiàn)，豬肺炎支原體可與豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV），圓環(huán)病毒2型（PCV2）以及其他病原體混合感染，使感染的嚴重程度進一步提高，造成養(yǎng)豬業(yè)的重大經(jīng)濟損失[6]。因此，及時準確地檢測豬群中豬肺炎支原體的感染情況變得尤為重要。日前，用于檢測豬肺炎支原體的方法主要包括分離培養(yǎng)法、免疫熒光法、核酸探針法和PCR法等[7]。傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法費時，操作復(fù)雜，對技術(shù)要求高，除非在條件具備的實驗室作特殊的診斷外，一般不將分離培養(yǎng)作為病原診斷方法；免疫熒光法適用于急性感染期檢測，此時患病豬肺內(nèi)存在大量的病原。但患病豬在受到抗生素治療后或轉(zhuǎn)為慢性感染時，血清陽性豬支原體數(shù)量不足以用免疫熒光技術(shù)檢出而易出現(xiàn)假陰性；核酸探針法雖然簡單、靈敏，但各種類型支原體之間常有交叉反應(yīng)，易出現(xiàn)假陽性，影響檢驗準確性。PCR和實時熒光定量PCR方法雖然可以克服支原體培養(yǎng)難、易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的缺點，還具有敏感性高、特異性強的特點。然其敏感性非常好且能有效避免污染，但由于需要昂貴的試驗器材及試劑，且對實驗室環(huán)境要求高以及在檢測時易出現(xiàn)假陽性等缺點而難以推廣到臨床應(yīng)用[8]。研究根據(jù)GenBank上發(fā)表的豬肺炎支原體的核苷酸序列，針對該核苷酸序列設(shè)計4條特異性引物，其外引物擴增片段大小為276 bp，通過對內(nèi)外引物的比例、dNTP+濃度、Mg2+濃度和Bst DNA聚合酶用量等條件逐一優(yōu)化后，成功建立的豬支原體環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法（LAMP）。LAMP方法在恒溫60℃條件下1 h特異性較強，其敏感性為當(dāng)其豬肺炎支原體的拷貝數(shù)低于為3～6時，不能檢測到該病原體。且經(jīng)特異性試驗中檢測多殺性巴氏桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌、肺炎雙球菌、支氣管敗血波氏桿菌、副豬嗜血桿菌和鏈球菌均呈陰性。與常規(guī)PCR反應(yīng)相比，LAMP法大大縮短了檢測時間，且能夠特異性鑒別豬肺炎支原體，其敏感性與常規(guī)PCR方法一致，但該方法具有較好的臨床應(yīng)用性。

應(yīng)用LAMP技術(shù)診斷結(jié)果表明：對來自黑龍江不同地區(qū)的患豬呼吸道疾病的肺臟病料64份進行檢測，54份診斷為陽性，陽性率84.3%。健康豬鼻拭子共176份，經(jīng)LAMP檢測，157份陽性，陽性率為89.20%。健康豬鼻拭子帶菌率較高，這一檢測結(jié)果與郭盼盼等的報道基本一致，應(yīng)引起獸醫(yī)工作者高度重視。

［1］Fablet C，Marois C，Kobisch M，et al.Estimation of the sensitivity of four sampling methods for Mycoplasma hyopneumoniae detection in live pigs using a Bayesian approach［J］.VetMicrobiol，2010，143（2）：238-245.

［2］Marois C，Dory D，F(xiàn)ablet C，et al.Development of a quantitative Real-Time TaqMan PCR assay for determination of the minimal dose of Mycoplasma hyopneumoniae strain 116 required to induce pneumonia in SPF pigs［J］.JAppl Microbiol，2010，108（5）：1523-1533.

［3］Caron J，Ouardani M，Dea S.Diagnosis and differentiation of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyorhinis infections in pigs by PCR amplification of the p36 and p46 genes［J］.JClin Microbiol，2000，38（4）：1390-1396.

［4］Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop-mediated i-sothermal amplification of DNA［J］.Nucleic acids research，2000，28（12）：63-67.

［5］李鵬，馬艷嬌，于劍，等.豬肺炎支原體環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法的建立［J］.中國生物制品學(xué)雜志，2011，24（4）：480-483.

［6］趙東升，劉有昌，李祥健，等.豬肺炎支原體與其他病原的相互作用［J］.養(yǎng)豬，2008（5）：66-68.

［7］侯美如，侯喜林，高俊峰，等.牛輪狀病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2011（3）：19-23.

［8］郭盼盼，黃書林，張躍偉，等.環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)快速診斷豬肺炎支原體［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2010，18（4）：822-826.