譚君，侯喜林，余麗蕓，2，李劍華，王桂華，曹寧

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院；3.大慶油田總醫(yī)院）

干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）是人體和動(dòng)物腸道中一種正常的益生菌，被公認(rèn)為安全級(jí)（generally recognized as safe，GRAS）微生物[1]，具有多種生理功能，如控制腸道感染、增加某些食物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、控制血清膽固醇水平、改善乳糖代謝、誘導(dǎo)體內(nèi)特異性及非特異性免疫應(yīng)答以及抗腫瘤活性等功能。因此，干酪乳桿菌可作為安全的口服疫苗和其他病原體的抗原載體[2-5]。乳桿菌在腸道達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，可以抑制腸道中及自然界中某些有害微生物的生長(zhǎng)。益生菌的一個(gè)重要性質(zhì)指標(biāo)是對(duì)病原菌的抑菌活力[5]。因此實(shí)驗(yàn)對(duì)表達(dá)產(chǎn)腸毒素性大腸埃希氏菌K88抗原的重組基因工程乳酸菌的抑菌性能進(jìn)行研究，為其口服疫苗的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌種：重組K88干酪乳桿菌由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)基因工程實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；指示菌：豬源金黃色葡萄球菌（S.aureus）由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存，產(chǎn)腸毒素性大腸埃希氏菌（Enterotoxigenetic E.coli，ETEC）C83902株購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。

培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基用于培養(yǎng)乳酸菌；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基用于培養(yǎng)指示菌。

1.2 乳酸菌上清液的制備

將重組K88干酪乳桿菌接種于液體MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)36 h后，8 000 r·min-1離心10 min，用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌收集上清液，保存于4℃冰箱中備用。

1.3 檢測(cè)平板的制備

將2種致病菌原菌種接種于肉湯培養(yǎng)基中，37℃恒溫箱培養(yǎng)12 h后，用無(wú)菌生理鹽水稀釋成致病菌菌液備用，濃度約為105CFU·mL-1。用微量移液槍取致病菌液0.1mL置于制備好的營(yíng)養(yǎng)瓊脂檢測(cè)平板內(nèi)，用無(wú)菌玻耙將指示菌液在平板上涂布均勻，37℃恒溫干燥20min以固定菌液，使菌液滲入培養(yǎng)基表層內(nèi)，取出后即可進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.4 發(fā)酵上清液抑菌的檢測(cè)

采用牛津杯法做抑菌試驗(yàn)[6]。用鑷子夾取無(wú)菌牛津杯輕輕放入檢測(cè)平板培養(yǎng)皿中，在水平放置的平皿中均勻放置4只牛津杯。吸取乳酸菌上清液0.2mL至牛津杯中（注意不要將上清液溢出杯外）。每種致病菌分別做3個(gè)重復(fù)樣，1個(gè)對(duì)照樣，對(duì)照樣只加液體MRS。然后將加好上清液的培養(yǎng)皿正面放置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈，測(cè)抑菌圈直徑。

1.5 不同pH值對(duì)上清液的抑菌效果

用稀鹽酸、氫氧化鈉溶液調(diào)乳酸菌上清液pH值分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察不同pH值下的抑菌效果，取3次平行測(cè)定的平均值。同時(shí)設(shè)乳酸作對(duì)照。

1.6 加熱后上清液的抑菌效果

將乳酸菌上清液水浴加熱到100℃保持15 min用于抑菌實(shí)驗(yàn)，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察加熱后上清液抑菌效果，取3次平行測(cè)定的平均值。以未經(jīng)熱處理的上清液為對(duì)照。

1.7 胃蛋白酶處理后上清液的抑菌效果

檢測(cè)胃蛋白酶處理后上清液的抑菌效果[7]。將乳酸菌上清液分裝于 eppendorf管中（5 mL上清液/管），用無(wú)菌水將胃蛋白酶配成10%的溶液（酶的活力單位1∶250），按1mg·mL-1酶的量取50μL酶溶液，用加樣器加入裝有乳酸菌發(fā)酵上清液的eppendorf管中，混勻，37℃恒溫靜止孵育2 h后，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。觀察經(jīng)胃蛋白酶處理后發(fā)酵液的抑菌效果，取3次平行測(cè)定的平均值。對(duì)照組加入等量的未經(jīng)蛋白酶處理的上清液。

2 結(jié)果與分析

2.1 干酪乳桿菌發(fā)酵液的抑菌效果

通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察到乳酸菌上清液對(duì)ETEC（圖1）和S.aureus（圖2）均有明顯的抑菌效果，且抑菌圈大小均在15mm以上。測(cè)量所得到抑菌圈大小的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表1）。

2.2 不同pH值對(duì)上清液抑菌效果的影響

不同pH值對(duì)乳酸菌代謝產(chǎn)物抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果具有明顯影響，pH值越低，乳酸菌代謝產(chǎn)物的抑菌效果越好；當(dāng)pH為2.0時(shí)抑菌最明顯，隨著pH的升高抑菌作用逐漸減弱。在pH為5.0時(shí)，乳酸菌代謝產(chǎn)物失去了抑菌活力（見(jiàn)表2）。

圖1 發(fā)酵液對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的抑菌效果Fig.1 Bacteriostasis effect of fermentation broth on ETEC

圖2 發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果Fig.2 Bacteriostasis effect of fermentation broth on S.aureus.

表1 發(fā)酵液對(duì)致病菌的抑菌效果Table 1 Bacteriostasis effect of fermentation broth on pathogenic bacteria

表2 不同pH條件下發(fā)酵上清液對(duì)致病菌的抑菌效果Table 2 Bacteriostasis effect of supernate on pathogenic bacteria under different pH

2.3 加熱后上清液抑菌效果的影響

經(jīng)熱處理后培養(yǎng)基上產(chǎn)生的抑菌圈大小和對(duì)照組相比發(fā)現(xiàn)抑菌圈變化不明顯，由此表明乳酸菌代謝產(chǎn)物中的抑菌活性物質(zhì)的熱穩(wěn)定性較好（見(jiàn)表3）。

表3 加熱后上清液的抑菌效果Table 3 Bacteriostasis effectof supernate after heating treatment

2.4 蛋白酶處理后上清液抑菌效果的影響

經(jīng)胃蛋白酶溶液作用后，乳酸菌上清液的抑菌圈直徑也未發(fā)生明顯改變?？梢?jiàn)抑菌活性物質(zhì)對(duì)蛋白酶不敏感，即酶不能破壞抑菌物質(zhì)的活性（見(jiàn)表4）。

表4 酶處理后上清液的抑菌效果Table4 Bacteriostasis effectof supernate after pepsin treatment

3 討論

試驗(yàn)以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌作為抑菌試驗(yàn)的指示菌，不僅因?yàn)樗鼈兪菍?dǎo)致禽畜患病的病原菌，而且它們分別是常見(jiàn)的革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的代表。乳酸菌代謝產(chǎn)物的抑菌活性是多方面的，主要由有機(jī)酸、細(xì)菌素等物質(zhì)發(fā)揮作用[8]。試驗(yàn)采用牛津杯法，研究干酪乳桿菌對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的體外抑制效果。結(jié)果表明，干酪乳桿菌代謝產(chǎn)物對(duì)2種菌株均具有很強(qiáng)的抑制作用。李南薇[9]等研究了不同pH值對(duì)乳酸菌代謝產(chǎn)物抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果，結(jié)果表明pH值對(duì)乳酸菌代謝產(chǎn)物的抑菌能力具有明顯影響，pH值越低，乳酸菌代謝產(chǎn)物的抑菌效果越好。實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)pH值對(duì)乳酸菌代謝產(chǎn)物的抑菌能力具有明顯影響，pH值越低，乳酸菌代謝產(chǎn)物的抑菌能力越強(qiáng)。這可能是由于在較低的pH值條件下，酸性物質(zhì)大量積累，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)繁殖受到抑制。大量研究表明，乳桿菌可以在動(dòng)物腸道內(nèi)正常定植，通過(guò)代謝產(chǎn)生有機(jī)酸（主要是乳酸），降低腸道內(nèi)的pH和氧化還原電勢(shì)，使腸道處于酸性環(huán)境，從而抑制病原性細(xì)菌如致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等的生長(zhǎng)[10-13]。實(shí)驗(yàn)同時(shí)用乳酸做對(duì)照實(shí)驗(yàn)，從結(jié)果可知，當(dāng)對(duì)照液pH值為2.0、3.0時(shí)，產(chǎn)生的抑菌圈明顯小于離心上清液相同pH產(chǎn)生的抑菌圈，這樣排除了單是酸產(chǎn)生抑菌的可能性。說(shuō)明對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用是由pH值本身和乳酸菌代謝產(chǎn)物共同作用造成的。楊穎[14]等用胃蛋白酶和100℃水浴加熱20min處理提取的抑菌物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)依然保持較高的抑菌活力。實(shí)驗(yàn)的乳酸菌發(fā)酵上清液經(jīng)加熱、酶處理后的抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，抑菌圈變化不明顯，乳酸菌代謝產(chǎn)物具有良好的熱穩(wěn)定性且抑菌活性物質(zhì)對(duì)蛋白酶不敏感。

ETEC K88基因工程乳酸菌有望成為預(yù)防仔豬腹瀉的新型口服疫苗，其本身能夠產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對(duì)腸道致病菌有抑制作用，因此，采用該菌飼喂仔豬除了可以發(fā)揮其疫苗的功效，可以調(diào)整腸道微生物菌群的平衡，從而充分發(fā)揮其促進(jìn)健康的功效。

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