苑志明，勞杉杉，秦智偉，周秀艷

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030）

維生素C別名抗壞血酸（Ascorbic acid，AsA），是藻類、高等植物和大多數(shù)動(dòng)物體內(nèi)合成的一種己糖內(nèi)酯化合物?？箟难峥梢郧宄矬w內(nèi)代謝產(chǎn)生的活性氧（Reactive oxidative species，ROS），一定濃度的ROS是生物體內(nèi)必須的，但ROS濃度過(guò)高會(huì)造成細(xì)胞損傷，引起生物衰老和死亡，逆境會(huì)造成植物體內(nèi)ROS升高[1]。高等植物抗壞血酸合成的L-半乳糖途徑中，L-半乳糖-1，4內(nèi)酯由GalLDH直接氧化成抗壞血酸，GalLDH是抗壞血酸合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶之一[2]。

由于人體內(nèi)缺乏抗壞血酸合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，只能從食物中攝取[3]。因此，園藝產(chǎn)品中的AsA含量已成為衡量品質(zhì)的重要指標(biāo)。黃瓜中抗壞血酸含量較低，到目前為止沒(méi)有研究能解釋這種現(xiàn)象。本試驗(yàn)通過(guò)克隆黃瓜中抗壞血酸合成的關(guān)鍵酶GalLDH，為今后研究黃瓜中抗壞血酸含量較低的原因，改良黃瓜的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為黃瓜D08108果肉，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院黃瓜課題組提供。雌花自然開花后10 d采樣，將果肉切成薄片用錫紙包好，并用液氮速凍后存于-80℃冰箱，用于提取RNA。將幼嫩的番茄（HN11）葉片稱取0.2 g用錫紙包好，并用液氮速凍后存于-80℃冰箱，用于提取DNA。番茄品種由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院提供。

載體pBI121和農(nóng)桿菌由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。黃瓜組織培養(yǎng)外植體選用栽培品種649，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院黃瓜課題組提供。

1.2 應(yīng)用RT-PCR克隆黃瓜GalLDH

1.2.1 總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄

稱取0.5 g果肉用Trizol法提取RNA，用SMA3000分光光度計(jì)檢測(cè)，用于逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。選用Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，取2 μL RNA用于逆轉(zhuǎn)錄，取3 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)cDNA質(zhì)量。

1.2.2 RT-PCR

根據(jù)GenBank中登錄的甜瓜GalLDH（AF252339.2）的基因序列設(shè)計(jì)引物，SGalLDH：5'GTTGGGG AATCATAAACC 3'和AGalLDH：5'AAACACTTATC CAACTGGACAAC 3'。以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用SGalLDH和AGalLDH進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件為：94℃5 min預(yù)變性后，94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min，循環(huán)35次，最后72℃延伸10 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物回收與測(cè)序

將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳30 min，百泰克多功能小量DNA回收試劑盒進(jìn)行膠回收，連接到pEASY-T3載體（全式金）上，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α菌株中，并涂在含有50 mg·mL-1Amp+、IPTG和X-gal的LB平板上，挑選白色菌落，放入含有Amp+的5 mL液體LB培養(yǎng)基中，37℃條件下，200 r·min-1，過(guò)夜。百泰克質(zhì)粒小量回收試劑盒提取質(zhì)粒，F(xiàn)ermentas快速內(nèi)切酶Eco RⅠ37℃酶切5 min，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的片段。由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成測(cè)序。

1.3 2A12果實(shí)特異性啟動(dòng)子的克隆

CTAB法提取番茄幼嫩葉片DNA，擴(kuò)增2A12基因的引物序列為S2A12：5'AGCACTTGTTAGA CTCATCTG 3'和 A2A12：5'AATGGTTTTGGATTA ATTGC 3'，以番茄DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.4 酶切位點(diǎn)的添加

在S2A12添加HindⅢ位點(diǎn)即M-S2A12：5'GT CAAGCTTAGCACTTGTTAGACTCATCT 3'，在A2A12上添加X(jué)baⅠ位點(diǎn)即M-A2A12：5'GTATCTAGAAA TGGTTTTGGATTAATTGC 3'。在SGalLDH上添加X(jué)baⅠ位點(diǎn)即M-SGalLDH:5'GTCTCTAGAGTTGGG GAATCATAAACC 3'，在AGalLDH上添加SmaⅠ位點(diǎn)即M-AGalLDH:5'GATCCCGGG AAACACTTATC CAACTGGACAAC 3'。

1.5 表達(dá)載體的構(gòu)建和檢測(cè)

對(duì)含有GalLDH目的片段（已添加酶切位點(diǎn)）的pEASY-T3載體和pBI121分別用Fermentas快速內(nèi)切酶XbaⅠ和SmaⅠ進(jìn)行雙酶切，進(jìn)行膠回收，然后用Fermentas T4連接酶進(jìn)行連接；將連接好的中間載體和含有2A12基因（已添加酶切位點(diǎn)）的pEASY-T3載體分別用Fermentas快速內(nèi)切酶HindⅢ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切，進(jìn)行膠回收，然后用Fermentas T4連接酶進(jìn)行連接，將連接好的載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。用CTAB法提取黃瓜總DNA。

1.6 黃瓜GalLDH的cDNA生物學(xué)分析

采用Primer premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析開放閱讀框；采用ExPASy的ProtParam Tool（http://www.expasy.org/tools/protparam.html）分析編碼氨基酸理化性質(zhì)；應(yīng)用TreeView和CLUSTALX進(jìn)行序列比對(duì)和進(jìn)化樹構(gòu)建分析。

2 結(jié)果與分析

2.1RNA的質(zhì)量、黃瓜GalLDH的RT-PCR擴(kuò)增

提取黃瓜D08108果肉的總RNA，用SMA3000分光光度計(jì)檢測(cè)，OD260/280≈1.8，3015 ng·μL-1，取3 μL用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量見圖1（A），以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得一條1880 bp的特異性條帶見圖1（B）。

圖1 黃瓜果實(shí)總RNA（A）及GalLDH基因的RT-PCR擴(kuò)增（B）Fig.1 Total RNA(A)and RT-PCR product of GalLDH(B)from fruit of cucumber cultivar D08108

2.2 黃瓜GalLDH的生物學(xué)分析

黃瓜GalLDH經(jīng)測(cè)序是一個(gè)全長(zhǎng)為1880 bp cDNA序列，包含一個(gè)長(zhǎng)為1773 bp的完整開放閱讀框，在5'端有47 bp的非編碼序列，在3'端有60 bp的非編碼序列。其GenBank登錄號(hào)：HQ446099，堿基序列及推導(dǎo)的氨基酸序列如圖2所示，通過(guò)與GenBank中登錄的同源基因進(jìn)行核苷酸相似度比較，黃瓜GalLDH與甜瓜相似度最高，為96%，與獼猴桃相似度為76%，與其他物種相似度均在70%以上。

圖2 植物GalLDH基因氨基酸序列系統(tǒng)樹分析Fig.2 Phylogenetic tree of the deduced amino acid sequences of plant GalLDH gene

黃瓜GalLDH氨基酸序列的分子質(zhì)量為67297.2，理論等電點(diǎn)9.04，氨基酸數(shù)590，親水性平均值-0.475，不穩(wěn)定指數(shù)48.30，為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

2.3 表達(dá)載體構(gòu)建的檢測(cè)

對(duì)構(gòu)建好的載體進(jìn)行用SGalLDH：5'GTTGGG GAATCATAAACC 3'和 AGalLDH：5'AAACACTTAT CCAACTGGACAAC 3'、S2A12：5'AGCACTTGTTA GACTCATCTG 3'和A2A12：5'AATGGTTTTGGATT AATTGC 3'進(jìn)行PCR檢測(cè)，得到一條1880 bp的目的條帶和一條850 bp的目的條帶（見圖3）。

圖3 重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.3 Detection of recombinant plasmid by PCR

2.4 轉(zhuǎn)基因黃瓜的檢測(cè)

選用2A12啟動(dòng)子的特異引物對(duì)轉(zhuǎn)基因黃瓜進(jìn)行檢測(cè)，共得到13株再生植株，其中轉(zhuǎn)基因植株5株。轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株擴(kuò)增條帶與預(yù)期一致，陰性植株沒(méi)有擴(kuò)增出條帶，第1道是構(gòu)建載體，第2道是陰性對(duì)照，3～7道是擴(kuò)增出的陽(yáng)性條帶（見圖4）。組培圖片中A是子葉節(jié)，B是組培苗，C是組培苗的生根過(guò)程，D是馴化中的組培苗（見圖5）。

圖4 轉(zhuǎn)基因黃瓜植株的PCR檢測(cè)Fig.4 Detection of transgenic Cucumis sativus by PCR

圖5 黃瓜組培Fig.5 Cucumber tissue culture

3 討論與結(jié)論

抗壞血酸含量的高低是衡量園藝產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[4]，抗壞血酸在光合作用和光合保護(hù)中起重要作用[5-6]?？箟难徇€可以作為一系列重要酶反應(yīng)的輔因子[3]，抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的相對(duì)比率影響植物的細(xì)胞分裂[7]。高等植物抗壞血酸的合成主要是通過(guò)L-半乳糖途徑，但是也不排除其他途徑的可能[8]。本試驗(yàn)中克隆的GalLDH在高等植物中普遍存在。目前造成黃瓜抗壞血酸含量低的原因并不明確，因?yàn)榭箟难釁⑴c植物體內(nèi)大量的代謝活動(dòng)，一直處在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的條件下。因此通過(guò)黃瓜GalLDH的克隆，為黃瓜中抗壞血酸含量的研究奠定基礎(chǔ)，為今后黃瓜抗壞血酸的研究起到輔助作用。不足之處，由于試驗(yàn)使用的是果實(shí)特異啟動(dòng)子，組培苗并未結(jié)瓜，所以無(wú)法檢測(cè)其抗壞血酸的含量變化。

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