鄭 蘭 樸松哲 金延澤，*

1.吉林省延邊大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科(延吉，133000);2.吉林省延邊大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)具有種植、浸潤、擴(kuò)散、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等類似于惡性腫瘤的特點，一些腫瘤相關(guān)因子如基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在內(nèi)膜異位癥中的作用日益受到重視，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)是其天然特異性抑制因子。近年研究表明，二者體內(nèi)表達(dá)與EMs的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本實驗通過建立大鼠EMs模型，觀察染料木黃酮(GEN)治療后移植物的體積變化和病理學(xué)改變，探討GEN對大鼠EMs組織中MMP-9和TIMP-1表達(dá)的影響，為臨床治療EMs提供一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及試劑

體重200～250g的Wistar雌性大鼠68只(清潔級)由延邊大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物科提供。GEN購于西安中鑫生物技術(shù)有限公司;17β-雌二醇購于北京天利生物化工公司;MMP-9兔抗大鼠多克隆抗體(即用型)、TIMP-1兔抗大鼠多克隆抗體(即用型)、SABC(兔IgG)-POD試劑盒購于武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 EMs模型建立 選擇有兩個以上正常動情周期(陰道涂片為大量無核角化細(xì)胞)的大鼠。造模前一天每只鼠皮下注射己烯雌酚0.1mg/kg.d，使其統(tǒng)一處于動情期。模型組(60只):10%的水合氯醛300mg/kg腹腔注射麻醉，腹部備皮，切口約2cm，鈍鑷找到并分離出大鼠右側(cè)子宮，在右側(cè)子宮靠近輸卵管處及兩側(cè)子宮交接處分別結(jié)扎，剪下中間的子宮片段，迅速置于盛有生理鹽水的彎盤中，沿系膜部位剪開管狀子宮，切割成4mm×4mm大小的子宮片，注意區(qū)分內(nèi)外膜。鈍性分離腹壁切口兩側(cè)的腹肌與皮下筋膜層，以正好能置入子宮片為宜，左右各一，分別將切割好的子宮片平整地置入兩側(cè)腔隙底部，使內(nèi)膜面緊貼腹肌，逐層連續(xù)縫合腹部切口，常規(guī)關(guān)腹。注意觀察大鼠的呼吸、心跳，等待其自然蘇醒。正常組(A組，8只):開腹之前同造模組，腹后將右側(cè)子宮角結(jié)扎，常規(guī)關(guān)腹。目的使該組達(dá)到與模型組均為單側(cè)宮角子宮的生殖環(huán)境。

1.2.2 術(shù)后處理方法 術(shù)后所有大鼠均常規(guī)禁食水6h，并肌內(nèi)注射青霉素0.1ml/d預(yù)防感染，共5d。術(shù)后第2天開始為造模組大鼠肌注17β-雌二醇0.1mg/kg.d，溶解于 0.1ml芝麻油中，每隔 3d 1 次共21d，以促進(jìn)異位內(nèi)膜生長。假手術(shù)組僅注射同劑量芝麻油。手術(shù)后每周觀察2次，有無形成包塊，21d后觀察移植物的生長情況，用游標(biāo)卡尺測量移植物的體積(長×寬×高，mm3)并記錄，術(shù)后無大鼠因感染死亡。

1.2.3 實驗分組及給藥方法 將EMs組大鼠隨機(jī)分為4組:模型組(B組，15只)每日皮下注射芝麻油0.05ml。GEN治療組分為低劑量組(C 組，0.5mg/kg，15 只)，中劑量組(D 組，5mg/kg，15 只)，高劑量組(E 組，100mg/kg，15 只)，將 GEN 溶解于 0.05ml芝麻油中，日1次皮下注射，A組同B組每日皮下注射芝麻油 0.05ml，共 84d。

1.2.4 病理檢查 末次給藥后24h時取出移植物測量其體積。全部標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚4～5μm，HE染色，光鏡下觀察。

1.2.5 觀察指標(biāo) 治療前、后造模組大鼠移植物體積變化;病理學(xué)變化;全部標(biāo)本做HE染色，觀察各組移植物腺體厚度和內(nèi)膜上皮細(xì)胞的厚度;觀察移植物內(nèi)膜中MMP-9和TIMP-1的表達(dá)。

1.2.6 結(jié)果判定 MMP-9陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)為腺上皮細(xì)胞胞漿呈棕黃色著色，間質(zhì)中也有表達(dá)。隨機(jī)選取高倍鏡(×400)下至少5個視野［1］，結(jié)果按染色強(qiáng)度分為陰性(-)，弱陽性(+)，中等陽性(++)，強(qiáng)陽性(+++)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，采用Fisher確切概率法。

2 結(jié)果

2.1 治療前后移植物體積變化

造模后第3周，所有造模組大鼠左或右下腹可見子宮內(nèi)膜種植結(jié)節(jié)。剪去大鼠腹部毛發(fā)可見種植物呈類球形突出，其內(nèi)部充滿淡黃色或淡紅色液體，與周圍組織有輕度粘連。GEN治療12周后，C組、D組大鼠種植物肉眼觀察治療前后情況相近，測量體積無明顯差異;E組移植物萎縮成扁平的斑塊狀物，治療前后體積有差異(P＜0.01)。見表1。

2.2 移植物鏡下觀察

EMs組60只大鼠，鏡下觀察建模成功41只。A組子宮內(nèi)膜腺體無擴(kuò)張，腺上皮排列規(guī)整，間質(zhì)少量炎細(xì)胞浸潤;B組腺體存活良好，部分腺體擴(kuò)張，囊壁內(nèi)泡沫細(xì)胞浸潤，腺腔內(nèi)充滿蛋白樣物;C組與B組比較移植物腺體無明顯變化，腺體周圍少量纖維組織增生;D組腺體輕度擴(kuò)張，腺上皮被擠壓，變扁，部分處脫落，周圍泡沫細(xì)胞浸潤，腺體周圍較多纖維組織增生。E組腺體明顯萎縮，部分脫落入腔內(nèi)，脫落超過50%，腺上皮被擠壓，變扁，周圍大量纖維組織增生。見圖1。

表1 各組GEN治療前后移植物體積比較(mm3，±s)

表1 各組GEN治療前后移植物體積比較(mm3，±s)

組 別 n 11 141.26 ±12.01 146.34 ±21.33 C 組(低劑量組) 9 130.95 ±20.18 139.62 ±25.47 D 組(中劑量組) 10 132.60 ±24.61 116.00 ±26.64 E組(高劑量組)治療前 治療后B組(模型組)11 133.10 ±28.82 72.74 ±21.44

2.3 免疫組化分析

2.3.1 MMP -9表達(dá)情況 B 組(8 例，74.7%)與 A組(1例，12.5%)內(nèi)膜組織中MMP-9陽性表達(dá)率明顯增高(P ＜0.05);C 組(6例，66.7%)、D 組(6例，60.0%)與B組比較MMP-9陽性表達(dá)率無明顯差異;E組(2例，18.2%)與B組比較MMP-9陽性表達(dá)率明顯下降(P＜0.05)。見圖2。

2.3.2 TIMP -1 的表達(dá)情況 B 組(3例，27.3%)與A組(7例，87.5%)TIMP-1陽性表達(dá)率明顯降低(P ＜0.01);C 組(4例，44.4%)、D 組(5例，50.0%)與B組比較TIMP-1陽性表達(dá)率無明顯差異(P＞0.05);E組(9例，81.8%)與 B組比較TIMP-1陽性表達(dá)率升高(P＜0.05)。見圖3。

3 討論

EMs是一種激素依賴性疾病，具有類似惡性腫瘤的特性，即遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和侵襲的特性。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解和重建是子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［2］。MMPs是一組能降解大多數(shù) ECM及各種類型膠原的鋅依賴性蛋白水解酶，在許多生理和病理過程中都發(fā)揮著重要作用。其中MMP-9由于經(jīng)常表達(dá)于具有高轉(zhuǎn)移潛能的癌株而備受關(guān)注，TIMPs是近年來發(fā)現(xiàn)的MMPs的天然抑制物，二者在協(xié)調(diào)ECM成分的合成與降解過程中起重要作用。本實驗中，MMP-9和TIMP-1在正常子宮內(nèi)膜及EMs組織中均有陽性表達(dá)，主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞胞漿中。B組中異位內(nèi)膜組織MMP-9異常高表達(dá)，而TIMP-1表達(dá)水平降低。MMP-9與TIMP-1表達(dá)失衡，可能改變了腹腔ECM的生長和重建過程，促使ECM降解，增強(qiáng)子宮內(nèi)膜異位癥病灶的侵襲性，從而有助于EMs的發(fā)生發(fā)展［3］。由此可見EMs組織中MMP-9表達(dá)增強(qiáng)，TIMP-1表達(dá)減弱，與EMs發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［4］，MMP-9與TIMP-1表達(dá)失衡可能是EMs發(fā)病的機(jī)制之一。

實驗結(jié)果表明:GEN可以抑制大鼠EMs組織腺體中MMP-9陽性表達(dá)，GEN高劑量組效果最為明顯，GEN低劑量組和中劑量組無明顯差異，MMP-9表達(dá)與GEN劑量成量效關(guān)系，高劑量的GEN抑制大鼠EMs組織腺體中MMP-9的過度表達(dá)，抑制其降解ECM的能力，阻止異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞不斷破壞基底膜，降解腹膜及周圍組織，達(dá)到治療效果。免疫組化結(jié)果顯示:GEN具有上調(diào)大鼠EMs組織腺體中TIMP-1陽性表達(dá)的作用，增強(qiáng)了EMC的防御能力，使異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞在腹腔內(nèi)種植、生長、擴(kuò)散的能力減弱。GEN治療后EMs組織中MMP-9表達(dá)下降，TIMP-1表達(dá)升高，說明GEN可以下調(diào)MMP-9且上調(diào)TIMP-1的表達(dá)，恢復(fù)二者間的平衡，抑制ECM的降解，增強(qiáng)其防御能力，抑制異位內(nèi)膜細(xì)胞在腹腔內(nèi)種植、生長、擴(kuò)散。另外，有試驗和臨床數(shù)據(jù)表明，異位內(nèi)膜組織越多，其周圍血供就越豐富，在異位內(nèi)膜組織中，MMP-9高表達(dá)和TIMP-1低表達(dá)與異位病灶區(qū)血管生成呈正相關(guān)［5］，為EMs增殖、擴(kuò)散創(chuàng)造了條件。GEN能下調(diào)MMP-9的表達(dá)水平，上調(diào)TIMP-1的表達(dá)水平，調(diào)節(jié)MMP-9/TIMP-1之間的平衡，抑制血管生成素誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞出芽生長等，防止ECM降解，維持血管穩(wěn)定性，抑制EMs的發(fā)展。

GEN可抑制大鼠EMs模型中異位內(nèi)膜的生長，其抑制作用可能與MMP-9表達(dá)下降和TIMP-1表達(dá)升高，平衡MMP-9和TIMP-1的表達(dá)有關(guān)。GEN有望成為一種治療EMs的新物質(zhì)，MMP-9/TIMP-l的調(diào)節(jié)受多種因素影響，其確切機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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［責(zé)任編輯:王麗娜］