趙忠?guī)r，王江濱，劉冬琦，李 巖

（吉林大學(xué)1.中日聯(lián)誼醫(yī)院a.急救醫(yī)學(xué)科；b.消化內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春 130033；2.公共衛(wèi)生學(xué)院）

＊通訊作者

幽門(mén)螺桿菌是人類(lèi)最常見(jiàn)的病原性細(xì)菌，是慢性胃炎、消化性潰瘍等疾病發(fā)生的主要病因，并與胃腺癌、胃粘膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)，WHO已將其列為一類(lèi)致癌因子［1］。由于目前根除HP治療方案存在許多弊端，近年來(lái)人們逐漸開(kāi)始關(guān)注微生態(tài)療法在HP根除治療中的應(yīng)用，有研究發(fā)現(xiàn)，益生菌中的某些菌株對(duì)HP的生長(zhǎng)具有抑制作用［2］，本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)研究從健康人糞便中篩選并建立了具有拮抗HP國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株SS1和NCTC11637作用的嗜酸乳桿菌L6，對(duì)其耐酸、耐堿等生物學(xué)特性及其在胃內(nèi)存留時(shí)間和毒理進(jìn)行了深入的研究［3］，證明該株嗜酸乳桿菌具有穩(wěn)定的抑制HP國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株作用。本研究旨在探討該株嗜酸乳桿菌拮抗幽門(mén)螺桿菌作用的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 嗜酸乳桿菌L6的建立及培養(yǎng)方法 L6由本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)從健康體檢者糞便中篩選而建立，采用固體培養(yǎng)法傳代培養(yǎng)，收集細(xì)菌后調(diào)整細(xì)菌濃度分別為9logCFU／ml、8logCFU／ml、7logCFU／ml。

1.2 SGC－7901細(xì)胞株及培養(yǎng)方法 SGC－7901細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。細(xì)胞培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI1640（Gibco BRL）完全培養(yǎng)液，細(xì)胞置于含5%CO2、95%空氣的CO2孵箱中，在37℃、95%濕度條件下培養(yǎng)。

1.3 L6與SGC－7901細(xì)胞的黏附及其對(duì)細(xì)胞存活率的影響 將SGC－7901細(xì)胞接種于內(nèi)置載玻片的含20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液的6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，用RPMI1640沖洗2次，分別加入終濃度為7logCFU／ml、8logCFU／ml和9logCFU／ml的嗜酸乳桿菌L6 PMI1640培養(yǎng)液，在37℃，5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，分別于1、6、12、和24 h終止培養(yǎng)，取出載玻片，PBS漂洗2次，自然干燥，甲醇固定15 min，革蘭染色，油鏡下隨機(jī)選擇50個(gè)細(xì)胞，計(jì)算其可視性細(xì)胞表面的細(xì)菌數(shù)，計(jì)算黏附指數(shù)（黏附細(xì)菌數(shù)／細(xì)胞數(shù)×100%）的均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差，同時(shí)選擇與L6粘附的SGC－7901細(xì)胞以臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行染色并計(jì)數(shù)其細(xì)胞總數(shù)和存活細(xì)胞數(shù)，換算成細(xì)胞存活率（活細(xì)胞數(shù)／細(xì)胞總數(shù)x 100%）。

1.4 嗜酸乳桿菌L6對(duì)HP與SGC－7901細(xì)胞黏附的拮抗效應(yīng) 將已有SGC－7901細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的載玻片置于6孔培養(yǎng)板中，當(dāng)SGC－7901細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，以下述3種方法分別觀察嗜酸乳桿菌L6對(duì)HP的拮抗效應(yīng)。（1）排除實(shí)驗(yàn)：先將不同濃度的嗜酸乳桿菌L6分別加入6孔培養(yǎng)板上（37℃，5%CO2）30 min，洗滌去除未黏附的L6，然后再加入HP懸液，繼續(xù)孵育30 min后計(jì)數(shù)HP黏附指數(shù)。（2）競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)：將HP懸液與不同濃度L6同時(shí)加入6孔培養(yǎng)板中混勻，1 h后洗滌3次，以后處理方法同上。（3）替換實(shí)驗(yàn)：先將HP懸液加入6孔培養(yǎng)板中（37℃，5%CO2），30 min后，洗滌去除未黏附的HP，然后再加入不同濃度的L6，混勻后繼續(xù)孵育30 min，處理方法同上。

1.5 上清液中IL－8的測(cè)定 將SGC－7901細(xì)胞懸浮在24孔板RPMI1640培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h后，將HP與不同濃度的嗜酸乳桿菌L6加入培養(yǎng)液中共同培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)6、12、24 h后取上清液通過(guò)ELISA方法測(cè)定IL－8的含量，并與單獨(dú)加入HP和單獨(dú)加入9logCFU／ml嗜酸乳桿菌進(jìn)行比較。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用方差分析及t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 嗜酸乳桿菌L6具有與SGC－7901細(xì)胞黏附的能力，其黏附指數(shù)在一定時(shí)間范圍內(nèi)隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增高，在黏附后12 h達(dá)高峰。此外，黏附指數(shù)還隨細(xì)菌濃度的增加而增高，與對(duì)照組比較有顯著性差異，P＜0.05，見(jiàn)表1。

2.2 嗜酸乳桿菌 黏附 、12和 的7901細(xì)胞的存活率與未被黏附的細(xì)胞存活率相比無(wú)顯著差異，且細(xì)胞存活率不受細(xì)菌濃度及黏附時(shí)間的影響，見(jiàn)表2。

2.3 嗜酸乳桿菌L6對(duì)HP與SGC－7901細(xì)胞的黏附具有明顯的拮抗作用，且這種拮抗作用隨細(xì)菌濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，與單純HP組比較差異顯著，P＜0.05；與L6的作用時(shí)間早晚有一定關(guān)系，排除實(shí)驗(yàn)比替換實(shí)驗(yàn)明顯增強(qiáng)，兩者比較差異顯著，P＜0.05，見(jiàn)表3。

2.4 嗜酸乳桿菌L6可以明顯拮抗HP誘導(dǎo)SGC－7901細(xì)胞產(chǎn)生IL－8，且隨著細(xì)菌濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其對(duì)HP誘導(dǎo)的IL－8分泌的拮抗作用逐漸增強(qiáng)，12 h后，濃度為9logCFU／ml組明顯高于濃度為7logCFU／ml組和濃度為8logCFU／ml組，各組比較差異顯著，P＜0.05；而嗜酸乳桿菌L6本身幾乎不刺激上皮細(xì)胞分泌IL－8，見(jiàn)表4。

表1 嗜酸乳桿菌L6與SGC－7901細(xì)胞粘附能力分析

表2 嗜酸乳桿菌L6粘附SGC－7901細(xì)胞后細(xì)胞存活率的比較

表3 嗜酸乳桿菌L6對(duì)HP與SGC－7901細(xì)胞粘附拮抗作用分析

表4 嗜酸乳桿菌L6對(duì)HP誘導(dǎo)IL－8分泌的抑制效應(yīng)

3 討論

幽門(mén)螺桿菌（HP）是人類(lèi)最常見(jiàn)的病原性細(xì)菌，是慢性胃炎、消化性潰瘍等疾病發(fā)生的主要病因，并與胃腺癌、胃粘膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)，WHO已將其列為一類(lèi)致癌因子。HP對(duì)胃粘膜造成損害的前提是必須黏附于胃粘膜上皮細(xì)胞，進(jìn)一步引起上皮細(xì)胞的某些行為改變，如分泌炎性細(xì)胞趨化因子，激活中性粒細(xì)胞等，同時(shí)胃上皮細(xì)胞還可作為抗原呈遞細(xì)胞引發(fā)T淋巴細(xì)胞的活化，最終導(dǎo)致中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞在胃粘膜內(nèi)浸潤(rùn)，引起胃粘膜炎癥反應(yīng)［4，5］。HP在人類(lèi)的感染率已高達(dá)50%以上，其感染引起的炎癥反應(yīng)是其重要的致病機(jī)制之一［6］。由于HP為非侵入性細(xì)菌，其所引起的炎癥反應(yīng)是通過(guò)第二信使來(lái)完成的，關(guān)于第二信使目前研究較多的是炎癥細(xì)胞趨化因子，如IL－2、IL－6、IL－8及腫瘤壞死因子等，特別是IL－8研究的比較深入，是目前比較肯定的炎癥介質(zhì)，其誘導(dǎo)的炎細(xì)胞聚集是HP引起胃粘膜病變的關(guān)鍵因素，并且有研究進(jìn)一步證明，只有活的HP才能誘發(fā)IL－8的分泌，且HP與胃粘膜上皮細(xì)胞的黏附是誘發(fā)上皮細(xì)胞IL－8分泌的先決條件［7］。從以上的研究中我們可以看出，阻斷HP的黏附是治療HP感染的重要環(huán)節(jié)。

益生菌是通過(guò)改善胃腸內(nèi)菌群的平衡，對(duì)宿主起到有益作用的活性微生物，具有抵御外源細(xì)菌定植所表現(xiàn)出的定植抗性，即益生菌通過(guò)黏附素與粘膜上皮細(xì)胞受體黏附，然后占位定植，以阻止病原菌與粘膜受體結(jié)合從而抑制病原菌的黏附［8］。黏附是益生菌發(fā)揮作用的首要條件，因此，益生菌的定植抗性是衡量其生態(tài)效應(yīng)的重要指標(biāo)。

嗜酸乳桿菌是人類(lèi)胃腸道內(nèi)主要的益生菌，有研究表明，其有明顯的拮抗HP的作用，但其作用機(jī)制尚不清楚，可能與嗜酸乳桿菌對(duì)胃上皮細(xì)胞的高度親和力有關(guān)，由于嗜酸乳桿菌的快速生長(zhǎng)使得它能分泌大量的乳酸，可以直接對(duì)黏附在上皮細(xì)胞的HP起抑制作用，而不干擾胃粘膜的粘液層［10］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌能阻止HP在鼠胃內(nèi)的定植，這可能與嗜酸乳桿菌阻礙了HP的黏附有關(guān)［10］。嗜酸乳桿菌對(duì)胃粘膜表面的選擇性黏附被認(rèn)為是影響其在有胃液存在的環(huán)境中定植的一個(gè)重要因素，嗜酸乳桿菌產(chǎn)生的乳酸、乙酸、乙酰醋酸等有機(jī)酸在消化道粘膜的分布明顯多于消化道內(nèi)容物的分布，這些黏附在消化道粘膜表面的有機(jī)酸，對(duì)消化道病菌的黏附也起到一定的屏障作用［13－14］。

本研究以黏附和黏附抑制為切入點(diǎn)，選用胃粘膜上皮細(xì)胞為靶細(xì)胞，觀察了嗜酸乳桿菌對(duì)胃黏膜上皮細(xì)胞的粘附情況，結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)室篩選的嗜酸乳桿菌L6對(duì)胃黏膜上皮細(xì)胞具有粘附性，隨濃度的增加粘附性逐漸增強(qiáng)，且粘附后不影響細(xì)胞的存活率；L6對(duì)HP與胃黏膜上皮細(xì)胞的粘附起拮抗作用，且在HP與胃黏膜細(xì)胞粘附之前應(yīng)用嗜酸乳桿菌的拮抗作用更明顯；嗜酸乳桿菌L6還可抑制HP誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞分泌Il－8，而其本身并不引起IL－8的分泌，為嗜酸乳桿菌L6在微生態(tài)制劑開(kāi)發(fā)中的價(jià)值提供依據(jù)。

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