馮成利， 黨蕊葉， 馮 慧， 劉曉農(nóng)， 權(quán)清轉(zhuǎn)

(陜西省動(dòng)物研究所, 陜西 西安 710032)

0 引言

膠原是動(dòng)物結(jié)締組織的主要成分，廣泛存在于動(dòng)物的皮膚、骨、軟骨、腱等組織器官中，并對(duì)各器官正常生理功能的調(diào)節(jié)起著舉足輕重的作用.它是動(dòng)物機(jī)體含量最多的一種蛋白質(zhì)，其相對(duì)分子量高達(dá)300 KD.膠原多肽是膠原經(jīng)水解提純而獲得的，其相對(duì)分子量為數(shù)千到30 KD[1]，含有18種氨基酸[2,3]，具有水溶性強(qiáng)，粘度低，易被人體吸收等特點(diǎn)[4]，其消化吸收率接近100%，能最大程度地發(fā)揮出膠原的各種功能.攝食膠原多肽可促進(jìn)骨的形成，增強(qiáng)低鈣水平下的骨膠原結(jié)構(gòu)，從而提高骨強(qiáng)度，預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的作用；還可促進(jìn)膠原的生物合成，改善隨年齡增長(zhǎng)而導(dǎo)致的人體有關(guān)組織的衰老和功能減退；因而對(duì)關(guān)節(jié)癥等膠原病具有很好的預(yù)防和治療作用；此外，膠原多肽還具有其他許多特殊的生理功能，如保護(hù)胃黏膜和抗?jié)儯种蒲獕荷仙茸饔肹5,6].膠原多肽的生物學(xué)功能和藥用保健功能等正在被人們所認(rèn)識(shí)，這方面的研究也逐漸成為研究的熱點(diǎn)[7].

水解蛋白的方法有化學(xué)降解法和生物酶降解法[3,8].化學(xué)降解法包括酸法和堿法，酸法水解是強(qiáng)酸在高溫下反應(yīng)，設(shè)備要求高，腐蝕嚴(yán)重，產(chǎn)物為單體氨基酸，且色氨酸被破壞；堿法水解使氨基酸大多消旋[9]，即L-氨基酸變成D-氨基酸，利用價(jià)值降低；酶法水解條件溫和，無環(huán)境污染，保留了原料的全部營(yíng)養(yǎng)成分.本實(shí)驗(yàn)利用胰蛋白酶水解新鮮豬皮，對(duì)水解條件進(jìn)行了較為系統(tǒng)的探索，為水解膠原蛋白的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、材料與試劑

1.1.1儀器

(1)HH-SL電熱恒溫水浴，北京科偉永興儀器有限公司；

(2)JJ-1定時(shí)電動(dòng)攪拌器，江蘇省金壇市正基儀器有限公司；

(3)80-2離心沉淀器，上海醫(yī)療器械廠；

(4)pH110酸度計(jì)，梅特勒公司.

1.1.2材料與試劑

(1)新鮮豬皮，市售；

(2)食品級(jí)胰蛋白酶， 活性4030 u/g,重慶勁康生物技術(shù)有限公司；

(3)甲醛、NaOH、酚酞等均為分析純?cè)噭?

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1豬皮膠原液的制備

將市售的新鮮豬皮，去除脂肪，切成1cm的小方塊，用水清洗，再用丙酮室溫浸泡3次，每次浸泡4h，回收丙酮，加入一定量的水，加熱至125 ℃，蒸煮2.0h，再放至室溫備用.

1.2.2水解方法

將不同濃度的豬皮溶液，調(diào)pH后，在設(shè)定溫度下加入胰蛋白酶，混合均勻，并間歇攪拌，反應(yīng)一定時(shí)間后，于沸水浴中滅活5min，待冷卻至室溫，以4000 r/min，離心30 min，取上清液保存于冰箱，待用[10].

1.2.3水解度(DH)的測(cè)定方法

水解度是衡量蛋白質(zhì)水解程度的主要指標(biāo)，它指蛋白質(zhì)被酶水解時(shí)所打開的肽鍵數(shù)占總肽鍵數(shù)的百分?jǐn)?shù).本文采用甲醛滴定法測(cè)量溶液的水解度，具體操作按照《生化實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)》[11]中的方法進(jìn)行，并按照下列公式計(jì)算水解度[12]:

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與探討

胰蛋白酶是從豬、牛、羊等動(dòng)物胰臟中提取的一種混合酶制劑，主要成分有胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶，另外還含有胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、羧基肽酶等多種蛋白水解酶.胰蛋白酶只水解賴氨酸和精氨酸等堿性氨基酸殘基的羧基所形成的肽鍵；胰凝乳蛋白酶則優(yōu)先水解L-酪氨酸和L-苯丙氨酸的羧基所形成的肽鍵；而彈性蛋白只有彈性蛋白酶能水解.胰酶中各組分的比例，因提取方法不同而不同，其水解能力也會(huì)隨組分的變化而變化.

2.1 pH對(duì)胰酶水解膠原蛋白的影響

在底物濃度為25%，水解溫度48 ℃，胰酶量4%(胰酶重量占新鮮豬皮重量的百分?jǐn)?shù)表示，下同)的條件下，分別調(diào)節(jié)溶液的pH值為6.0，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，水解時(shí)間2h，結(jié)果見圖1.

圖1 pH對(duì)胰酶水解豬皮膠原蛋白的影響

胰酶最適pH值因底物的種類、濃度不同而不同，從圖1中可以看出：pH在7.0～8.0之間時(shí),胰酶對(duì)豬皮的水解效果較好.本試驗(yàn)采用pH為7.5.

2.2 胰蛋白酶量對(duì)胰酶水解膠原蛋白的影響

在底物濃度為25%，水解溫度48 ℃，pH為7.5的條件下，分別控制溶液的酶量為1.0%，2.0%，3.0%，4.0%，5.0%，6.0%，7,0%，8.0%，9.0%，10.0%，水解2h，結(jié)果見圖2.

圖2 酶量對(duì)胰酶水解豬皮膠原蛋白的影響

從圖2可以看出：胰酶的水解度隨酶量的增加而增加，當(dāng)酶量大于4%以后，增加的幅度變小.考慮酶的效率及生產(chǎn)成本，研究過程選用4%的用酶量.

2.3 底物濃度對(duì)胰酶水解膠原蛋白的影響

將700 g新鮮豬皮，按照上面工藝處理，加工成35%的豬皮溶液，再依次配制成35%，30%，25%，20%，15%的溶液，在水解溫度48 ℃，pH為7.5，酶量為4%的條件下水解2h，結(jié)果見圖3.

圖3 豬皮濃度對(duì)胰酶水解豬皮膠原蛋白的影響

底物濃度的大小對(duì)胰蛋白酶水解豬皮膠原蛋白效果的影響比較明顯，濃度太大和太小都不利于水解反應(yīng)的進(jìn)行.從實(shí)驗(yàn)結(jié)果及圖3可看出，最佳的底物濃度為25%.

2.4 水解時(shí)間對(duì)胰酶水解膠原蛋白的影響

在底物濃度為25%，水解溫度48 ℃，pH為7.5，酶量為4%的條件下進(jìn)行胰酶水解實(shí)驗(yàn)，每15 min測(cè)定樣品的氨基氮，結(jié)果見圖4.

圖4 水解時(shí)間對(duì)胰酶水解豬皮膠原蛋白的影響

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果及圖4可以看出，胰蛋白酶對(duì)豬皮膠原的水解速度開始很快，30 min已完成了80%，隨后水解速度逐漸減慢，120 min后溶液的氨基氮達(dá)1.27 mg/mL，反應(yīng)完成了98%以上，隨后溶液的氨基氮升幅很慢.本試驗(yàn)采用水解時(shí)間為2h.

2.5 溫度對(duì)胰酶水解豬皮膠原蛋白的影響

在底物濃度為25%，加酶量為4%， pH為7.5條件下，分別控制不同的水解溫度進(jìn)行水解度的測(cè)試實(shí)驗(yàn).控制酶解的溫度分別為42 ℃、45 ℃、48 ℃、51 ℃、54 ℃，水解2h，結(jié)果見圖5.

圖5 溫度對(duì)胰酶水解豬皮膠原蛋白的影響

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果及圖5可以看出，在51 ℃之前，溫度對(duì)胰蛋白酶水解豬皮膠原的水解度影響不大，而在48 ℃時(shí)，水解度達(dá)到最大值，此后隨著溫度的增加，水解度下降.而在51 ℃之后，水解度下降迅速.酶解溫度宜選48 ℃.

2.6 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定最適水解條件，并按正交表L9(34)設(shè)計(jì)正交表1[13]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2.

表1 正交實(shí)驗(yàn)方案

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)水解度及極差的分析結(jié)果可看出，酶量是重要影響因子，豬皮濃度是次要因子， 溫度對(duì)指標(biāo)影響最小.正交試驗(yàn)得到的最佳水解條件為pH7.5，水解溫度48 ℃，酶與豬皮比40 mg/g，底物濃度25%，水解時(shí)間2 h.

2.7 說明

本實(shí)驗(yàn)胰蛋白酶水解反應(yīng)的正交試驗(yàn)所選各因子的水平值，以及單因子實(shí)驗(yàn)其它條件控制等，是根據(jù)商品酶的說明、供應(yīng)商的建議，以及以往大量實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)選取，并不能完全說明其它商品胰酶水解反應(yīng)的取值范圍.實(shí)驗(yàn)所得到的結(jié)果和結(jié)論，僅代表本實(shí)驗(yàn)工藝下所選生產(chǎn)商提供的商品酶，并不代表所有胰酶水解反應(yīng)條件，但從中可以提供一些實(shí)驗(yàn)方法或規(guī)律性東西來參考.

3 結(jié)論

胰蛋白酶對(duì)豬皮的水解，隨著胰蛋白酶含量的增加而水解度增加，但胰蛋白酶量大于4%以后，水解速度的增加幅度減??；pH7～8時(shí),胰蛋白酶對(duì)豬皮水解的水解度達(dá)到最大值；水解反應(yīng)的開始反應(yīng)速度較大，30 min后反應(yīng)速度降低，2 h可使98%的豬皮水解；酶水解反應(yīng)的酶量是重要影響因子，豬皮濃度是次要因子，溫度對(duì)指標(biāo)影響最??；胰酶水解豬皮的最佳條件為：pH7.5，水解溫度48 ℃，酶與豬皮比40 mg/g，底物濃度25%，水解時(shí)間2 h.在此條件下豬皮的水解度可達(dá)16%.

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