劉默洋，張淑紅，張 賽

（1. 唐山師范學(xué)院 化學(xué)系，河北 唐山 063000；2. 唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系，河北 唐山 063000）

玉米大斑病菌STK1基因DNA片段的分離和純化

劉默洋1，張淑紅2，張 賽2

（1. 唐山師范學(xué)院 化學(xué)系，河北 唐山 063000；2. 唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系，河北 唐山 063000）

玉米大斑病是玉米生產(chǎn)上的重要病害，分離和純化玉米大斑病菌STK1基因?qū)τ谘芯科渲虏⌒跃哂兄匾饬x。根據(jù)STK1基因cDNA序列設(shè)計特異性引物，以玉米大斑病菌基因組DNA為模板擴增得到STK1基因DNA片段。該基因片段的分離和純化，為進一步獲得STK1的完整基因，進行基因結(jié)構(gòu)分析和該基因的突變體構(gòu)建奠定了良好的基礎(chǔ)。

玉米大斑病菌；STK1基因；分離和純化

玉米大斑病是當(dāng)今世界上玉米主要葉部病害之一，在嚴重流行年份和地區(qū)，常常造成大面積減產(chǎn)[1-2]。玉米大斑病的發(fā)生是由于玉米大斑病菌的成功侵入和產(chǎn)生致病毒素—HT-毒素[3]。

MAPK，也稱細胞外信號調(diào)節(jié)激酶，它們在生物體內(nèi)的多種細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中占有非常重要的地位[4]。近期研究表明，MAPK途徑對玉米大斑病菌的發(fā)育和致病性也有重要的調(diào)控作用。在不同真菌中同源MAPK基因之間相似程度非常高，利用已知MAPK蛋白的保守序列設(shè)計引物，完全可以擴增出玉米大斑病菌的MAPK同源基因，例如玉米小斑病菌的CHK1基因[5]，玉米網(wǎng)斑病菌的PTK1基因[6]，水稻稻瘟病菌的MPS1基因[7]。范永山等[8]提取玉米大斑病菌總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，設(shè)計簡并寡核苷酸引物，獲得了玉米大斑病菌的一個完整MAPK表達基因，即STK1基因。

獲得玉米大斑病菌MAPK表達基因后，需要創(chuàng)建該基因的突變體，以確定該基因的確切功能，這就要求必需知道玉米大斑病菌STK1基因的基因組DNA序列。獲得STK1基因的基因組DNA序列不但有利于該基因的功能研究，還為以后進行基因定位、以該基因作為靶基因進行病害防治和該基因的轉(zhuǎn)基因利用奠定基礎(chǔ)。因此，本試驗根據(jù)STK1基因的cDNA序列設(shè)計引物，對該病菌基因組DNA進行擴增，以獲得STK1基因DNA片段，分析其可能的結(jié)構(gòu)，以及該基因上游和下游的調(diào)控序列，獲得STK1基因全長序列，為進一步研究該基因的表達調(diào)控提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

玉米大斑病菌菌株01-11，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素實驗室提供。

1.2 引物設(shè)計

以STK1基因的cDNA序列為模板利用DNA Star軟件設(shè)計一對特異性引物。

1.3 玉米大斑病菌基因組DNA的提取及檢測

利用CTAB法[9]提取玉米大斑病菌的基因組DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測其質(zhì)量和濃度。

1.4 STK1基因的PCR擴增

以提取的玉米大斑病菌基因組DNA為模板，按下列反應(yīng)體系進行PCR擴增。

PCR反應(yīng)體系為（25 μL)：DNA（40 ng/μL）2 μL，引物STK1-1(10μM) 2 μL，引物STK1-2(10μM) 2 μL，dNTP Mixture（各2.5 mM）2 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，ddH2O 14.3 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃變性3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min；4 ℃ pause。30個循環(huán)。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 PCR擴增產(chǎn)物回收、純化和PCR驗證

利用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）純化、回收PCR擴增產(chǎn)物。以回收產(chǎn)物為模板，按下列反應(yīng)體系進行PCR擴增。

PCR反應(yīng)體系為（25 μL)：回收的DNA 2 μL，引物STK1-1(10 μM) 2 μL，引物STK1-2(10 μM) 2 μL，dNTP Mixture（各2.5 mM）2 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/ μL）0.2 μL，ddH2O 14.3 μL。PCR反應(yīng)條件同上。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米大斑病菌基因組DNA的提取及檢測

瓊脂糖凝膠電泳（圖1）檢測，提取的基因組DNA較完整。所提取的DNA經(jīng)紫外分光光度計測量OD260和 OD280，以O(shè)D260/OD280的比值檢測DNA純度并計算DNA濃度約為3 120 ng/μL。

2.2 STK1基因的PCR擴增

從圖2可以看出，擴增產(chǎn)物中約0.9 kb的譜帶亮度清晰，因此這條帶最有可能是目的擴增條帶。但由于擴增時可能產(chǎn)生了其它非特異性擴增，需要將此擴增產(chǎn)物進行DNA回收和純化。

2.3 PCR產(chǎn)物的凝膠分離、純化及PCR驗證

將擴增產(chǎn)物用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒進行回收和純化。回收產(chǎn)物經(jīng)PCR擴增后利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，圖3顯示回收產(chǎn)物的擴增譜帶清晰，回收產(chǎn)物為純化的STK1基因片段。

3 結(jié)論

以玉米大斑病菌STK1基因的cDNA序列為模板，利用DNAStar軟件設(shè)計了一對引物STK1-1和STK1-2，并以玉米大斑病菌基因組DNA為模板擴增得到0.9 kb的STK1基因片段，利用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒對STK1基因片段進行回收，經(jīng)過PCR驗證，回收產(chǎn)物為純化的STK1基因片段。實驗結(jié)果可用于進一步的研究，如測序分析其外顯子和內(nèi)含子；為構(gòu)建突變體進一步研究該基因功能奠定基礎(chǔ)；獲得STK1全長DNA序列：利用3′RACE技術(shù)獲得STK1基因cDNA序列的3′端，再根據(jù)3′端序列設(shè)計引物，與已獲得的STK1基因DNA片段中設(shè)計的引物進行擴增。

[1] 王立秋,田新久.玉米大斑病研究現(xiàn)狀及建議[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),1998,4:32-33.

[2] 高衛(wèi)東,戴法超.玉米大斑病研究的新進展[J].植物病理學(xué)報,1993,23(3):193-195.

[3] 董金皋.農(nóng)業(yè)植物病理學(xué)(北方本)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2001:84-85.

[4] S. H. Yang, A. D. Sharrocks, A. J. Whitmarsh. Transcriptional regulation by the MAP kinase signaling cascades[J]. Gene, 2003, 320: 3-21.

[5] S. Lev, A. Sharon, R. Hadar, Ma H, et al. A mitogen-activated protein kinase of the corn leaf pathogen Cochliobolus heterostrophus is involved in conidiation, appressorium formation, and pathofenicity, diverse roles for mitogen-activated protein kinase homologs in foliar pathogens[J]. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1999,96: 13542-13547.

[5] M. C. Ruiz-Roldán, F. J. Maier, W. Schafer. PTK1, a mitogen-activated-protein kinase gene, is required for condition, appressorium formation, and pathogenicity for Pyrenophora teres on barley[J]. Plant-M icrobe Interact, 2001, 14:116-125.

[6] Y. Takano, T. Kikucki, Y. Kubo, et al. The Colletotrichum lagenarium MAP kinase gene CMK1 regulates diverse aspects of fungal pathogenesis[J]. Plant-Microbe Interact, 2000, 13:374-383.

[7] 范永山.玉米大斑病菌MAPK基因克隆和功能分析[D].河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2004.

[8] 安鑫龍,董金皋,韓建民.玉米大斑病菌的RAPD分析Ⅰ.應(yīng)用CTAB法提取玉米大斑病菌DNA[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2001,21(4):38-41.

（責(zé)任編輯、校對：李春香）

Separation and Purification of STK1 Gene Fragment in Setosphaeria Turcica

LIU Mo-yang1, ZHANG Shu-hong2, ZHANG Sai2

(1. Department of Chemistry, Tangshan Teachers College, Tangshan 063000, China; 2. Department of Life Science, Tangshan Teachers College, Tangshan 063000, China)

Northern corn leaf blight is an important disease in corn yield. Separation and purification of the STK1 gene in Setosphaeria turcica is important to study the pathogenicity. Two specific primers were designed to amplify STK1 gene from the genome DNA based on the known cDNA sequence of STK1 gene. The study has faciliated the further cloning, mutant design and function analyses of STK1 gene in the pathogen.

Setosphaeria turcica; STK1 gene; separation and purification

Q75

A

1009-9115(2012)02-0049-03

河北省自然科學(xué)基金項目（C2010001854）

2011-10-14

劉默洋（1989-），男，河北唐山人，唐山師范學(xué)院化學(xué)系學(xué)生。