祁培培，丁瑩瑩，吳莉莉，陳秋莉，王錦紅，劉超，廖文婷，張婧，曹潔，潘衛(wèi)

1 中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)教研室，上海 200433

2 安徽醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，安徽 合肥 230032

細(xì)菌免疫球蛋白結(jié)合蛋白 (Immunoglobulin (Ig)-binding proteins，IBPs) 是一類由細(xì)菌產(chǎn)生的特異結(jié)合宿主抗體的細(xì)菌免疫球蛋白結(jié)合蛋白，是細(xì)菌重要致病因子之一[1-3]。研究最多的 IBPs有金黃色葡萄球菌蛋白A (Staphylococcal protein A，SpA)、鏈球菌 (C 和 G 群) 蛋白 G (Streptococcal protein G，SpG) 和部分大消化鏈球菌表面的蛋白 L (Peptostreptococcus magnus protein L，PpL)[4-8]。研究表明，細(xì)菌IBPs均包含由多個(gè)序列高度同源的結(jié)合結(jié)構(gòu)域頭尾相連重復(fù)組成的抗體結(jié)合區(qū)，每個(gè)單結(jié)構(gòu)域具有與全分子完全相同的結(jié)合特性，形成 Ig結(jié)合功能的基本單位。SpA含有5個(gè)高度同源的重復(fù)結(jié)構(gòu)域，自N端起分別為E、D、A、B、C，單個(gè)結(jié)構(gòu)域約58個(gè)氨基酸殘基大小，形成3股反向平行排列α-螺旋的空間結(jié)構(gòu)，與哺乳動(dòng)物IgG抗體重鏈中的第2及第3恒定區(qū) (CH2γ, CH3γ) 間的分界面結(jié)合，該結(jié)合以螺旋1和螺旋2與Fc的疏水作用為主并通過兩個(gè)分子之間的4對(duì)氫鍵得到進(jìn)一步穩(wěn)定[9-11]。Protein A還可以結(jié)合由人VHⅢ基因家族編碼的Fab片段，因此還能結(jié)合其他類型抗體[12-14]。SpG分子量為65 kDa，包含3個(gè)高度同源的Ig結(jié)合結(jié)構(gòu)域B1、B2和B3[15](為區(qū)別于SpA中的B，以下統(tǒng)稱G1、G2、G3)，與SpA不同，其單結(jié)構(gòu)域由4個(gè)串聯(lián)的β折疊和1個(gè)α螺旋組成[16-17]，也結(jié)合于IgGFc的CH2γ和CH3γ間的分界面上，與SpA的結(jié)合部位部分重疊。因其折疊結(jié)構(gòu)含量很高，Protein G結(jié)合Fc位點(diǎn)位于其螺旋和連結(jié)螺旋至 β-折疊3的環(huán)區(qū)中[18]。此外，Protein G可以結(jié)合 IgG的Fab段，其識(shí)別部位定位于 γ鏈的第 1個(gè)恒定區(qū)(CH1γ)，所以它僅結(jié)合IgG，并具有更高的親和力[19]。以SpA為代表的IBP已被廣泛用于抗體的純化、制備與鑒定、酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)與診斷、免疫沉淀試驗(yàn)、臨床體外免疫吸附治療，成為非常有價(jià)值的科研、診斷和治療工具[20-22]。

SpA和 SpG的這些單結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列高度同源但又存在細(xì)微差異，這些差異是否對(duì)IgG的結(jié)合特性產(chǎn)生影響？SpA和SpG為什么需要多個(gè)單結(jié)構(gòu)域的重復(fù)？這些問題尚沒有明確答案。以金黃色葡萄球菌為例，該細(xì)菌廣泛存在于自然界中，為多種動(dòng)物體表正常菌群的組成菌種，同時(shí)也可在特定條件下感染致病。然而，人和其他動(dòng)物IgG分子作為SpA和SpG作用的靶分子序列雖然同源，但進(jìn)化差異已明顯存在，并且在某些物種中存在多種亞類的IgG，人的IgG就存在四亞類。因此，理論上不同的IBP單結(jié)構(gòu)域的重復(fù)可產(chǎn)生具有不同結(jié)合特性組合以應(yīng)對(duì)不同物種、不同亞類IgG分子的這種多樣性。根據(jù)這一思路，我們嘗試應(yīng)用基于噬菌體展示的分子進(jìn)化方法對(duì)該問題進(jìn)行探索性研究。先前，本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用自主建立的基于噬菌體展示技術(shù)的分子進(jìn)化平臺(tái)，對(duì)噬菌體展示Protein A、Protein G、Protein L等IBPs的單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組合文庫并進(jìn)行體外進(jìn)化篩選獲得了 A-G2[23]、A-L[23](Protein L的B3結(jié)構(gòu)域)、LD3[24]及LD5[24-25]等多種新型進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子 (Novel evolved Ig-binding molecules，NEIBMs)，其中LD3和LD5為天然IBPs中不存在的單結(jié)合結(jié)構(gòu)域組合，這種組合被證實(shí)產(chǎn)生了天然 IBPs所沒有的抗體結(jié)合特性，即對(duì)Ig Fabκ輕鏈和VHⅢ重鏈的雙結(jié)合特性，該結(jié)合特性被證實(shí)大大提高了與IgM的結(jié)合力，并被成功地應(yīng)用于HCV的IgM檢測(cè)，充分顯示了分子進(jìn)化方法用于該研究的可行性。在本研究中，我們構(gòu)建了以SpA的A、B、C、D、E 5個(gè)結(jié)構(gòu)域和SpG的G2、G3結(jié)構(gòu)域7個(gè)單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組合的噬菌體展示文庫，并應(yīng)用人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4四亞類分子進(jìn)行體外進(jìn)化篩選，首次獲得了一種與人IgG四亞類均具有結(jié)合優(yōu)勢(shì)的新型組合分子D-C。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒載體和菌株

噬菌粒載體 pCANTAB5S由第二軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)教研室保存[26]；pCANTAB5S-SpA噬菌粒、pMD-18T-G2和pMD-18T-G3質(zhì)粒分別克隆有 SpA的 EDABC五結(jié)構(gòu)域基因 (GenBank Accession No. P02976)、SpG的B2和B3結(jié)構(gòu)域的基因 (GenBank Accession No. P06654) 為本室構(gòu)建保存；E. coli TG1和輔助噬菌體M13K07為本室保存。

1.1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、堿性磷酸酶 (CIP) 購自寶生物工程 (上海) 公司；高效連接液購自TOYOBO公司；質(zhì)粒抽提試劑盒及DNA Taq酶購自上海申能博彩生物公司；質(zhì)粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技(北京) 有限公司；氨芐青霉素 (Amp) 與卡那霉素 (Kana) 均購自華美生物公司；人IgG1、2、3、4四亞類分子購自Sigma公司；鼠抗噬菌體酶聯(lián)單抗 mouse anti-M13mAb-HRP購自 Amersham Pharmacia公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)本室保存的堿基序列設(shè)計(jì) 12條引物，序列見表1。應(yīng)用12條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得下游帶有3個(gè)氨基酸大小的隨機(jī)連接肽編碼序列(NNSNNSNNS) 的A、B、C、D、E、G2、G3七個(gè)結(jié)構(gòu)域的DNA片段，且片段兩端均引入XbaⅠ酶切位點(diǎn) (TCTAGA) 和53 bp保護(hù)序列。此外，用于PCR擴(kuò)增檢測(cè)噬菌粒pCANTAB5S中克隆片段及測(cè)序的上游引物pCANTAB5S-1序列為：5￠-CAACGTGAAAAAATTATTATTCGC-3￠，而下游引物pCANTAB5S-6序列為：5￠-GTAAATGAA TTTTCTGTATGAGG-3￠。以上引物均委托上海生工生物工程科技服務(wù)有限公司合成。

1.2.2 SpA和SpG七個(gè)單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組合噬菌體展示文庫的構(gòu)建

以pCANTAB5S-SpA噬菌粒為模板，分別以u(píng)A和dAD、uB和dB、uC和dC、uD和dAD、uE和dE為上下游引物，PCR擴(kuò)增SpA的A、B、C、D、E五結(jié)構(gòu)域片段；以u(píng)G2和dG2為上下游引物，分別以pMD-18T-G2、pMD-18T-G3質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增SpG的G2、G3結(jié)構(gòu)域片段；為延長保護(hù)堿基以提高酶切效率，再以Sec為上下游引物，分別以上述7個(gè)單結(jié)構(gòu)域片段的PCR產(chǎn)物為模板，PCR擴(kuò)增得到在兩端分別引入約50 bp個(gè)保護(hù)堿基的7個(gè)單結(jié)構(gòu)域片段。將7個(gè)片段的PCR產(chǎn)物純化后用XbaⅠ酶消化，與同樣酶切并用CIP酶去磷酸化處理的pCANTAB5S連接后轉(zhuǎn)化E. coli TG1超級(jí)感受態(tài)細(xì)菌 (其制備見文獻(xiàn)[27])。分別取0.1、1、10 μL轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌涂布LB (含100 mg/L Amp) 平皿，并計(jì)算庫容。隨機(jī)挑取23個(gè)轉(zhuǎn)化子對(duì)文庫中片段插入情況進(jìn)行 PCR鑒定，將插入多個(gè)結(jié)構(gòu)域片段的轉(zhuǎn)化子委托上海杰李生物技術(shù)有限公司 (以下簡(jiǎn)稱上海杰李) 進(jìn)行序列測(cè)定。剩余菌液繼續(xù)加入10 mL 2×YT (Amp) 培養(yǎng)基，37 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。加 500 μL 1.3×1012TU/mL的M13K07輔助噬菌體，37 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)1 h，加入Kana后，37℃，250 r/min振蕩培養(yǎng)8 h。1 000×g離心10 min，上清經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，即為展示SpA和SpG單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組合噬菌體文庫，滴度測(cè)定和無菌實(shí)驗(yàn)見文獻(xiàn)[28]和[29]。

表1 七個(gè)免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域片段的擴(kuò)增引物Table 1 Primers for amplification of DNA fragments encoding seven Ig-binding domains of SpA and SpG

1.2.3 人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4對(duì)噬菌體文庫的體外分子進(jìn)化篩選

應(yīng)用人 IgG四亞類分別對(duì)上述構(gòu)建的噬菌體文庫進(jìn)行4輪體外分子進(jìn)化篩選，詳細(xì)步驟參見文獻(xiàn)[23]。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室工作基礎(chǔ)，篩選過程中文庫空噬菌體所占比例的減少和展示多結(jié)構(gòu)域 (≥2個(gè)結(jié)構(gòu)域) 噬菌體的增加情況是監(jiān)測(cè)篩選是否有效的重要指標(biāo)，但因原代噬菌體文庫中零插入噬菌體比例很少，我們將原代庫噬菌體與零插入噬菌體在相同滴度下等體積混勻作為篩選的初始文庫 (經(jīng)PCR鑒定，空噬菌體占74%，展示一個(gè)結(jié)構(gòu)域的噬菌體占9%，展示多結(jié)構(gòu)的域噬菌體占 17%)。此外，為深入了解整個(gè)進(jìn)化過程中噬菌體克隆展示序列的變化情況，本研究從人IgG1、2、3、4四組的各代平板上的陽性單克隆中都分別隨機(jī)挑選 10個(gè)插入多結(jié)構(gòu)域片段的單克隆委托上海杰李進(jìn)行序列測(cè)定；若有插入多結(jié)構(gòu)域片段的單克隆總數(shù)不足10個(gè)，則將實(shí)際數(shù)目的單克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 ELISA鑒定優(yōu)勢(shì)組合分子噬菌體的結(jié)合活性

根據(jù)序列分析結(jié)果，將篩選獲得的優(yōu)勢(shì)組合D-C的單克隆，劃LB平板 (Amp)，37 ℃過夜培養(yǎng)。為保證結(jié)果的真實(shí)可靠，我們隨機(jī)挑取5個(gè)菌落分別接種于5管2×YT培養(yǎng)基 (Amp) 中，經(jīng)M13KO7拯救，制備成5管具有相同展示物卻分別來自不同單克隆的噬菌體，測(cè)定滴度后用作平行組實(shí)驗(yàn)。相同方法制備pCANTAB5S-SpA噬菌體和pCANTAB5S噬菌體，分別作為本實(shí)驗(yàn)陽性、陰性對(duì)照。取100 μL噬菌體加入用人IgG1包被的ELISA板條中，37 ℃、2 h后用PBST洗5次，加入鼠抗噬菌體酶聯(lián)單抗結(jié)合，37 ℃、2 h后PBST洗10次，TMB顯色后讀取OD450數(shù)值，檢測(cè)單克隆噬菌體與人IgG1的結(jié)合活性。同樣的方法檢測(cè)與人IgG2、3和4結(jié)合活性。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)ELISA檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體展示SpA和SpG單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組合文庫的構(gòu)建

經(jīng)PCR擴(kuò)增得到SpA的A、B、C、D、E和SpG的G2、G3共7個(gè)IBP單結(jié)構(gòu)域的DNA片段，純化后經(jīng) XbaⅠ酶消化，得到兩端帶有XbaⅠ酶切位點(diǎn)的7個(gè)單結(jié)構(gòu)域片段 (圖1)。

將上述7個(gè)IBPs單結(jié)構(gòu)域片段與經(jīng)同樣酶切并CIP處理后的噬菌粒pCANTAB5S連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞E. coli TG1，構(gòu)建的SpA和 SpG單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組合文庫的庫容量即轉(zhuǎn)化數(shù)為8.2×106CFU，原代噬菌體文庫的滴度為1.3×1012TU/mL。

從轉(zhuǎn)化平板上隨機(jī)挑取23個(gè)轉(zhuǎn)化子，對(duì)原代文庫結(jié)構(gòu)域片段插入情況的PCR檢測(cè)結(jié)果為：零插入的轉(zhuǎn)化子即5S載體自連的為3個(gè)，百分比為13%；插入單個(gè)結(jié)構(gòu)域片段的為14個(gè)，占61%；插入2個(gè)的為4個(gè)，占17%；插入3個(gè)的為2個(gè)，占 9% (圖 2)。原代文庫的結(jié)構(gòu)域片段插入率達(dá)87%。此外PCR鑒定的6個(gè)插入多個(gè)結(jié)構(gòu)域片段的陽性克隆序列測(cè)定結(jié)果顯示：在插入到噬菌粒上共14單結(jié)構(gòu)域片段中，A:B:C:D:E:G2:G3個(gè)數(shù)比為2:2:1:2:0:4:3，雖然E未測(cè)出，但根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室研究基礎(chǔ)，原代庫中插入的各片段具有隨機(jī)性；在14單結(jié)構(gòu)域片段中，插入片段的正反向之比為8:6，與 1:1相近，總插入片段的正反向也具有隨機(jī)性；在 14條隨機(jī)連接肽序列 (NNS)3中，第 1位N上 A:T:C:G為15:8:13:6，第2位N上A:T:C:G為7:9:14:12，所有S位上的G:C為26:16，均具有隨機(jī)性 (表 2)。因此我們構(gòu)建的文庫符合體外進(jìn)化篩選要求。

圖1 七個(gè)SpA、SpGIg結(jié)合單結(jié)構(gòu)域DNA片段的XbaⅠ酶消化電泳圖Fig. 1 Electrophoretic profile of XbaⅠdigestion of seven DNA fragments of Ig-binding mono-domains of SpA and SpG. M: DL2000 DNA marker (2 000 bp, 1 500 bp, 1 000 bp, 750 bp, 500 bp, 250 bp, 100 bp); 1?7: DNA fragments of A, B, C, D, E, G2, G3 respectively; 1’, 2’, 3’, 4’, 5’, 6’, 7’: A, B, C, D, E, G2, G3 fragments after XbaⅠdigestion respectively.

圖2 SpA、SpG單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組合原代文庫插入片段大小的PCR鑒定Fig. 2 Identification of the size of inserted fragments in the original library displaying randomly-rearranged various binding domains of SpA and SpG by PCR. M: DL2000 DNA marker (2 000 bp, 1 500 bp, 1 000 bp, 750 bp, 500 bp, 250 bp, 100 bp); 1?23: the number of 23 single clones; C: the phagemid pCANTAB5S for positive control; B: the negative control.

2.2 人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4對(duì)噬菌體展示SpA和SpG單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組合文庫的體外進(jìn)化篩選

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室對(duì)同類文庫的進(jìn)化篩選經(jīng)驗(yàn)[23-24]，因IgG具有2條Fc鏈，可以同時(shí)結(jié)合2個(gè)單結(jié)構(gòu)域，文庫中展示兩結(jié)構(gòu)域噬菌體所占比例的增加和空噬菌體的減少情況是檢測(cè)篩選是否有效的重要指標(biāo)。從圖3可知，在所有人IgG四亞類進(jìn)化篩選中，展示兩結(jié)構(gòu)域片段克隆所占的比例持續(xù)穩(wěn)定地增加，最后文庫中基本全部進(jìn)化為兩結(jié)構(gòu)域組合分子；相反地，零插入克隆和插入單個(gè)結(jié)構(gòu)域片段克隆所占比例不斷降低，最后基本被淘選消失，這種變化充分顯示了篩選的有效性。R: reverse sequence of original sequence; 9n: the sequence of random linking peptides composed of nine nucleotides.

表2 SpA、SpG單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組合原代文庫中噬菌體克隆插入片段的序列分析Table 2 Sequence analyses of inserted fragments on phage clones in the original library displaying randomly-rearranged various binding domains of SpA and SpG

圖3 經(jīng)人IgG四亞類篩選后各代噬菌體文庫中23個(gè)單克隆噬菌體插入片段的組成比例變化Fig. 3 Proportion of phage clones with different sizes of inserted fragments in 23 phage clones after each round of selection with four human IgG subclasses respectively (A?D).

為深入了解在整個(gè)進(jìn)化過程中兩結(jié)構(gòu)域的序列變化情況，本研究從人IgG四亞類篩選的各代文庫中都分別隨機(jī)挑選10個(gè)插入多結(jié)構(gòu)域片段的單克隆進(jìn)行測(cè)序，而在IgG1組的F1代、IgG3組的F1和F2代、IgG4組的F1和F2代中因插入多結(jié)構(gòu)域片段的單克隆數(shù)目較少，則按實(shí)際數(shù)目測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示：1) 第 1輪篩選中四亞類組共測(cè)得25種多結(jié)構(gòu)域組合分子，其中能正確展示的均為正向插入的多結(jié)構(gòu)域組合為17種，包括D9n2-C9n2(人IgG2組的第1輪篩選)。2) 第2輪篩選中四亞類組均出現(xiàn)一種新的組合分子D9n1-C9n1(以下簡(jiǎn)稱D-C)，然而所占的比例在四亞類中卻差別很大，IgG1最高，占50%，IgG2和IgG4次之，均為30%，而IgG3最低，僅為10%。3) 人IgG四亞類組在第3、4輪篩選最終都得到相同的優(yōu)勢(shì)組合分子，D-C。第4輪篩選后的文庫中隨機(jī)挑取10個(gè)克隆除IgG3組出現(xiàn)了30%的A9n-G39n，其余均為D-C，見表3。

表3 人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4誘導(dǎo)的進(jìn)化篩選各輪獲得展示片段的測(cè)序結(jié)果Table 3 Sequence analyses of inserted fragments on phage clones in the four rounds of post-selection libraries with four human IgG subclasses

2.3 ELISA檢測(cè) D-C噬菌體與人 IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的結(jié)合優(yōu)勢(shì)

將D-C、pCANTAB5S-SpA和pCANTAB5S三組分別制備5個(gè)單克隆噬菌體，并將其滴度均調(diào)整為約 1.0×1012TU/mL后在相同條件下進(jìn)行ELSIA比較3組噬菌體分別對(duì)人IgG四亞類的結(jié)合活性。ELISA結(jié)果顯示: D-C噬菌體和SpA噬菌體對(duì)人 IgG四亞類的結(jié)合活性均遠(yuǎn)強(qiáng)于陰性對(duì)照組；D-C噬菌體對(duì)人IgG四亞類的結(jié)合活性又均強(qiáng)于SpA噬菌體，兩組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)，且在人IgG四亞類中D-C噬菌體對(duì)IgG1的結(jié)合活性最強(qiáng)，IgG3組最弱。

圖4 ELISA比較 D-C噬菌體和 SpA噬菌體對(duì)人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的結(jié)合活性Fig. 4 Comparison of the binding activities of D-C and SpA phage clones with four human IgG subclasses respectively by ELISA.

3 討論

SpA和 SpG是細(xì)菌表面與宿主抗體特異結(jié)合的蛋白，是極具價(jià)值的診斷、治療及抗體制備工具。它們的各單結(jié)構(gòu)分別以天然的組合形式與哺乳動(dòng)物IgG的Fc結(jié)合。為探索SpA和SpG的各單結(jié)構(gòu)域重組后能否獲得對(duì)人 IgG各亞類優(yōu)勢(shì)結(jié)合的NEIBMs，本研究構(gòu)建展示SpA、SpG單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組合的噬菌體展示文庫，并應(yīng)用人IgG四亞類分子進(jìn)行體外進(jìn)化篩選。我們預(yù)期能獲得與各人 IgG亞類特異結(jié)合的不同的NEIBMs，然而，本研究的結(jié)果卻與預(yù)期相反，4種人 IgG亞類所誘導(dǎo)的分子進(jìn)化均得到了同一種優(yōu)勢(shì)分子，D-C組合。

我們所構(gòu)建的文庫庫容為8.2×106CFU，原代噬菌體文庫的滴度為1.3×1012TU/mL，對(duì)原始文庫中隨機(jī)挑取陽性單克隆的 PCR檢測(cè)顯示已插入結(jié)構(gòu)域片段的陽性克隆總計(jì)達(dá)87%。插入多結(jié)構(gòu)域片段的陽性克隆序列測(cè)定結(jié)果顯示原始文庫中的各片段插入情況、片段正反向比例、隨機(jī)連接肽序列 (NNS)3均具有隨機(jī)性。理論上，文庫中兩結(jié)構(gòu)域組合的方式應(yīng)為7×2×7×2=196，各單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)連接肽理論上的組合方式應(yīng)為(2×4×4)3×(2×4×4)3=1048576?？梢姡撐膸祀m然不能將所有的組合方式完全包含，但已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了對(duì) 2個(gè)及 2個(gè)以上結(jié)構(gòu)域組合充分展示的要求。這些結(jié)果表明我們所構(gòu)建的文庫在庫容、隨機(jī)性和多樣性方面能夠滿足篩選要求。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室對(duì)同類文庫的IgG及IgG Fc篩選經(jīng)驗(yàn)[23-24]，因IgG具有兩條Fc鏈，可同時(shí)結(jié)合兩個(gè)單結(jié)構(gòu)域，文庫中展示兩結(jié)構(gòu)域噬菌體比例的增加情況是監(jiān)測(cè)篩選是否有效的最重要的指標(biāo)。在人四IgG亞類的進(jìn)化篩選中，展示兩結(jié)構(gòu)域噬菌體的比例隨著篩選的進(jìn)行不斷增多，篩選到第3、4代時(shí)，文庫中基本已全部進(jìn)化為兩結(jié)構(gòu)域組合分子，這種變化充分顯示篩選的有效性。

該次篩選中我們還特別檢測(cè)了兩結(jié)構(gòu)域組合分子組成和序列在進(jìn)化過程中的變化情況。出乎我們意料的是，人 IgG1、IgG2、IgG3、IgG4篩選最終都得到具有相同的優(yōu)勢(shì)組合分子D-C，并且其隨機(jī)連接肽序列也完全相同。該優(yōu)勢(shì)組合分子D-C均在第2輪篩選中出現(xiàn)，然而所占的比例在四亞類中卻很大差別，IgG1最高，占50%，IgG2和IgG4次之，均為30%，而IgG3最低，僅為 10%。有意思的是，這樣的差別與 phage ELISA所反映的各亞類IgG與D-C的結(jié)合能力完全相符。人IgG1、IgG2、IgG4誘導(dǎo)的進(jìn)化3、4輪即已完全，D-C成為唯一的克隆，而 IgG3所誘導(dǎo)的篩選到第 4輪篩選時(shí)出現(xiàn)了 D-C和A9n-G39n兩種優(yōu)勢(shì)分子，其中D-C占70%，為相對(duì)優(yōu)勢(shì)分子。另外，原代文庫和四亞類的第1輪篩選后文庫兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組合中均未發(fā)現(xiàn)D-C，表明其在原代文庫中未形成優(yōu)勢(shì)。同時(shí)四亞類的第1、2輪篩選我們發(fā)現(xiàn)至少存在E-G3、D-G2、C-C、A-B等28種不同的正確展示的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組合分子，顯示了D-C的超強(qiáng)結(jié)合能力。的確，我們采用嚴(yán)格對(duì)照的噬菌體ELISA實(shí)驗(yàn)證明了 D-C噬菌體與人 IgG四亞類的結(jié)合均遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于 SpA噬菌體。因此兩結(jié)構(gòu)域組合分子序列的動(dòng)態(tài)變化情況很好地反映了篩選的有效性和D-C的意義。另外，在人IgG2組第1輪篩選中還出現(xiàn)了具有不同于D-C的隨機(jī)連接肽序列的D9n2-C9n2，然而在后續(xù)測(cè)序中再未出現(xiàn)過，最終D-C成為四亞類篩選的優(yōu)勢(shì)組合分子，這說明隨機(jī)連接肽的序列對(duì)D-C的結(jié)合功能有影響，的確，四亞類IgG最終篩選到的D-C隨機(jī)連接肽序列完全一致，被嚴(yán)格選擇。

上述結(jié)果均說明和證明了D-C與IgG的結(jié)合優(yōu)勢(shì)，然而，為什么D-C組合具有結(jié)合優(yōu)勢(shì)目前尚無明確解釋。SpA中五結(jié)構(gòu)域的天然組合順序是E-D-A-B-C，D-C組合不存在其中。我們應(yīng)用5種SpA的單結(jié)構(gòu)域和2種SpG的單結(jié)構(gòu)域共7種IgG Fc單結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)建噬菌體隨機(jī)組合文庫，因此理論上能產(chǎn)生同時(shí)正確結(jié)合兩條IgG Fc的雙結(jié)構(gòu)域正確組合為49種 (7×7)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過天然SpA和SpG所能產(chǎn)生出來的6種兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組合 (SpG分子中3個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的組合順序是G1-G2-G3，可產(chǎn)生2種組合)。此外，文庫中兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組合是通過3個(gè)氨基酸的隨機(jī)連接肽連接，這種方式比天然分子的直接連接對(duì)結(jié)合IgG Fc雙鏈更具有優(yōu)勢(shì) (隨機(jī)連接肽的序列對(duì)兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組合的結(jié)合功能有影響，見上段討論)。因此，產(chǎn)生出結(jié)合能力超過天然兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組合的分子完全可能。金黃色葡萄球菌感染多種宿主時(shí)，SpA能與多物種、多亞類IgG結(jié)合，其5個(gè)單結(jié)構(gòu)域的串聯(lián)可大大擴(kuò)展其結(jié)合譜，然而，由于基因容量的限制，使其無法容納更多的串聯(lián)體而限制其產(chǎn)生具有最強(qiáng)結(jié)合能力的組合。因此，我們所得到的在 SpA天然分子中不存在的具有強(qiáng)結(jié)合能力的D-C也具合理性。目前，我們正在進(jìn)行原核表達(dá)D-C融合蛋白，以期在分子水平上進(jìn)一步確證D-C的超強(qiáng)結(jié)合能力。

與其他3組相比，人IgG3組篩選中D-C富集偏慢，在第4輪篩選時(shí)除此還篩得一定比例的另一種組合分子A9n-G39n(30%)。噬菌體ELISA結(jié)果也顯示D-C與IgG3的結(jié)合活性在四亞類中最弱。根據(jù)人IgG1 (Gene ID:3500)、IgG2 (Gene ID:3501)、IgG3 (Gene ID:3502) 和 IgG4 (Gene ID:3503) 重鏈區(qū)CH2-CH3的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果 (圖5)，我們將SpA與人IgG的CH2-CH3區(qū)域的作用位點(diǎn)[30-31]進(jìn)行標(biāo)注 (陰影區(qū)域) 后發(fā)現(xiàn)與其他三亞類不同，人IgG3在第334、335位結(jié)合位點(diǎn)分別為R、F，我們推測(cè)其影響了IgG3的Fc構(gòu)象以及與 SpA結(jié)合，同時(shí)也引起了上述IgG3與其他IgG組進(jìn)化篩選的不同。

本研究用IgG四亞類對(duì)展示了SpA、SpG共 7個(gè)單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組合噬菌體文庫成功地進(jìn)行了體外分子進(jìn)化篩選，得到了天然SpA分子中不存在的具有強(qiáng)結(jié)合活性的D-C組合，不僅可為IgG純化、制備、檢測(cè)等方面的應(yīng)用提供了新的候選分子，還為細(xì)菌IBP結(jié)構(gòu)功能的進(jìn)一步研究提供了新的手段。

圖5 人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4四亞類Fc的CH2-CH3段序列比對(duì)分析Fig. 5 Alignment of amino acid sequences in CH2-CH3 of four human IgG subclasses. The binding sites of human IgG Fc with SpA are shaded.

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